SOD拟似剂Tempol改善间歇性低氧小鼠主动脉舒张功能

蒋 倩，圣 豪，刘国莹，余孝海，钟明奎

作者单位：安徽医科大学生理学教研室，合肥 230032

阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea, OSA)是影响5%普通人群和 18% 50岁以上老年人群的常见疾病[1-2]。OSA的特点是睡眠期间反复呼吸暂停，导致间歇性低氧和睡眠片段化，是高血压、缺血性心脏病、动脉粥样硬化、冠心病、中风等心脑血管疾病的独立危险因素。间歇性低氧(intermittent hypoxia，IH)可通过氧化应激、一氧化氮利用不足、全身炎性反应、交感神经过度激活和内皮修复能力降低等途径导致血管内皮功能障碍，进而增加高血压等心血管疾病的发生风险[3]。Tempol是一种抗氧化剂[4]，作为SOD类似物，可以穿透细胞膜并与细胞内和细胞外的氧自由基反应，通过清除ROS减少氧化应激保护血管内皮功能[5-6]。该研究旨在探讨口服Tempol对IH引起的小鼠心血管损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 36只雄性清洁级C57小鼠，体质量(24±3)g，由安徽长临河医药科技有限公司提供，合格证号[Scxk(皖)2017-001]。动物分笼饲养，自由摄食和饮水，通风良好，室温18～25 ℃。

1.1.2仪器 测氧仪(CYS-1型，南京新飞分析仪器制造有限公司)；DMT 620M血管张力测定系统(丹麦DMT公司)；倒置荧光显微镜，冰冻切片机(德国徕卡)；全自动酶标仪(南京德铁实验设备有限公司)。

1.1.3试剂 医用压缩氧气(浓度>99.9%)、压缩氮气(浓度>99.9%)由合肥众益化工产品有限公司充装；Dihydroethidium(DHE)、NO测试盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Tempol、乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)、硝普纳(sodium nitroprusside，SNP)、苯肾上腺素(phenylephrine，Phe)购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1IH模型的制备和分组 小鼠在适应性饲养1周后进行实验，随机分成正常氧量组(Control)、间歇性低氧组(IH)、间歇性低氧Tempol干预组(IH+Tempol)，每组12只。本研究采用IH诱导小鼠心血管损伤模型，通过氮气稀释原理，向低氧舱循环充入氮气和氧气，每一循环为9 min，4 min充入氮气，随之5 min充入氧气，由测氧仪监测间歇性低氧舱中的氧浓度，调节气体流量，使每一循环间歇性低氧舱内的最低氧浓度达到6%左右，持续时间为45 s左右，然后再逐渐恢复至21%，间歇性低氧舱内氮气和氧气的转换通过定时电磁转换器来完成(图1)。将IH组以及IH+Tempol组小鼠放进低氧仓内，进行每天8 h的间歇性低氧处理(9 ∶00 am-5 ∶00 pm)，连续4周。Control组除不入箱内，其余均与IH组进行相同处理。在间歇性低氧处理3周之后，IH+Tempol组连续1周每天使用Tempol(100 mg/kg)给予灌胃处理，而Control组和IH组则灌注相同体积0.9%生理盐水。实验第4周末，处死小鼠，进行血管离体实验。

图1 间断性低氧舱内氧含量的变换模式

1.2.2心脏重量指标测定 实验模型制备完成后，首先进行小鼠体质量测量，随即用10%水合氯醛(0.05 ml/10 g)腹腔注射麻醉。将麻醉小鼠固定，准备成套眼科剪与镊子打开小鼠胸腔，将心肺等器官充分暴露，随即将还在跳动的心脏迅速摘取，剥离多余结缔组织等，随后置于冰冷生理盐水中，轻轻冲洗，挤压多余血水，用吸水纸将心脏中多余水分吸除，称重后立即进行称重后液氮存放，计算心重指数为心脏重量/体质量(mg/g)；将小鼠胫骨完整分离出，取出测量长度，计算心脏重量/胫骨长度(mg/cm)的比值。

1.2.3离体血管张力检测 利用CO2吸入法麻醉并处死小鼠，采用上述方法摘取小鼠心脏后，紧贴小鼠脊柱，取出完整胸主动脉，操作需动作快速轻柔，对血管无牵拉。将血管放置在预先接通混合氧(95%O2和5%CO2)的Krebs溶液中，借助显微镜，将包裹在血管周围多余脂肪和结缔组织以及其他杂质从外壁上小心清除，使其达到干净透明状态。然后将胸主动脉分别截断为2 cm左右。手持眼科镊，将血管环固定在Myograph 张力器两端，浴槽中持续通入混合氧，预置5 ml的Krebs液，全程保持pH值7.4，温度37 ℃。待血管稳定后，再给予2 mN的前负荷，缓慢拉伸血管环，并利用Powerlab系统记录血管张力的变化。待平衡30 min后，加入高钾溶液刺激血管，每次60 mmol/L，2次/15 min。血管达到最大收缩时，吸出高钾溶液，随后用Krebs液洗脱残留药物，3次/15 min。随后加入3 μmol/L Phe刺激血管预收缩，在收缩达到稳定峰值时，加入ACh(10-8～10-5.5mol/L)或SNP(10-9～10-5mol/L)，检测血管内皮依赖性与内皮非依赖性舒张功能。ACh可激动血管内皮细胞M3亚型，促进内皮依赖性舒张因子(endothelium-derived relaxing factor, EDRF)之一NO的释放，从而引起邻近平滑肌细胞松弛，促使血管内皮性依赖性舒张；SNP致使平滑肌松弛，在血管平滑肌内代谢产生NO，引起血管非内皮依赖性舒张。

1.2.4胸主动脉中NO测定 取剥离干净的胸主动脉加入裂解液，使用低温超声裂解仪裂解组织，离心取上清液；使用裂解液将1 mol/L的NaNO2稀释成1、10、20、40、60、80、100 μmol/L的标准品；配制1 mol/L的NaNO2，参考说明书的操作步骤操作，用全自动酶标仪测量出吸光度(optical density, OD)值。

1.2.5胸主动脉中活性氧(reactive oxygen species，ROS)测定 将剥离干净的胸主动脉用OTC包埋，冰盒静置后放入液氮，最后置-80 ℃冰箱保存。使用冰冻切片机将包埋好的血管切成5μm的病理切片。将DHE ROS荧光探测液(5 μmol/L)与标本常温避光孵育5～ 20 min。DHE在超氧化物生成处被氧化成为氧化乙锭，与DNA相结合之后，可被激发出红色的荧光，通过荧光显微镜观察荧光的强度，并ImageJ软件计算血管内ROS含量。

2 结果

2.1 Tempol对IH小鼠主动脉舒张功能的影响离体血管张力检测结果显示：3组小鼠胸主动脉内皮依赖性舒张功能存在明显差异[F(2,15)=27.54，P<0.001](图2A)。与Control组相比，IH 4周后，Phe预收缩的胸主动脉环对ACh引起的内皮依赖性舒张显著降低(P<0.001)；口服SOD类似物tempol可改善IH引起的内皮依赖性舒张功能(P<0.001)，但不能完全恢复正常内皮依赖性舒张水平。3组间Phe预收缩的胸主动脉环对SNP引起的内皮非依赖性舒张差异无统计学意义(图2B)。提示IH可能是通过影响内皮细胞而不是平滑肌细胞引起血管舒张功能的改变。

2.2 Tempol对IH小鼠主动脉中ROS与NO含量的影响图3A-C依次为Control组、IH组、IH+Tempol组小鼠胸主动脉DHE荧光染色后显示ROS分布与浓度。荧光亮度与ROS含量正相关，亮度越强，ROS含量越多。分析结果显示：与Control组相比，IH组小鼠胸主动脉中ROS荧光强度显著升高(P<0.001)，口服Tempol可降低IH小鼠胸主动脉中ROS水平(P<0.001)，但不能恢复到正常水平(P<0.001)(图3D)。提示Tempol作为超氧阴离子清除剂可通过减少血管中活性氧的产生或者清除活性氧来发挥保护心血管的作用。NO测定结果显示：与Control组相比，IH组小鼠胸主动脉中NO含量降低(P<0.001)，口服Tempol后，可以提高IH小鼠胸主动脉中的NO含量(P<0.01)，但不能恢复到正常水平(P<0.001) (图3E)。提示Tempol可能是通过减少活性氧的产生，提高NO生物利用率来减少血管内皮功能损伤，从而发挥心血管保护作用。

2.3 Tempol对IH小鼠体质量和心脏重量的影响与Contol组相比，间歇性低氧4周后，IH组小鼠体质量显著降低[F(2,21)=15.28，P<0.001]，而心脏重量/体质量比值[F(2,21)=19.16，P<0.001]和心脏重量/胫骨长度比值[F(2,21)=12.08 ，P<0.001]显著增加，提示间歇性低氧小鼠出现心肌肥大。口服Tempol后，与IH组比较，IH+Tempol 组小鼠的体质量明显增加(P<0.01)，心脏重量/体质量比值(P<0.01)和心脏重量/胫骨长度比值(P<0.01)明显下降，提示Tempol可抑制IH小鼠心肌肥大。见表1。

表1 Tempol对间歇性低氧小鼠体质量和心脏重量的影响

图2 Tempol对IH小鼠主动脉内皮依赖性舒张功能的影响

图3 小鼠主动脉ROS和NO含量 SP×400

3 讨论

本研究显示经IH处理4周，可引起小鼠胸主动脉对ACh引起的内皮依赖性舒张功能下降、心肌肥大，胸主动脉中ROS增加而NO水平降低，提示IH引起的心血管功能障碍可能与氧化应激增加使NO的生物利用度下降有关；口服SOD类似物Tempol，使IH小鼠胸主动脉中ROS水平降低、NO浓度增加，改善IH引起的内皮依赖性舒张功能和心肌肥大。

OSA是多种心脑血管疾病的独立危险因素，是患者致残和死亡的主要原因，IH是OSA的主要病理生理学特点和损伤机制，被认为是引起心脑血管疾病的最为重要的因素[7]。反复IH可引起氧化应激和ROS增加，而ROS可作为信号分子在OSA引起的并发症中起着重要的作用，抑制ROS对心血管具有重要的保护作用[8]。ROS是氧在生物体内通过单电子还原产生化学性质活泼的物质，包括超氧阴离子(·O-2)、羟自由基(·OH)和过氧化氢(H2O2)等。细胞内的ROS来源于氧化酶催化的代谢产物和线粒体电子传递链，涉及ROS代谢的酶有NAD(P)H 氧化酶(NOX)、黄嘌呤氧化酶、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢(CAT)等。超氧化物会氧化生物分子，与NO的反应促进过氧亚硝酸盐的形成，减少NO的生物利用度。而在SOD的作用下CAT酶和谷胱甘肽过氧化物酶则可将过氧化氢转化为水和氧气，在ROS的代谢中发挥了重要作用。Tempol 是一种可透膜的金属非依赖性SOD拟似物，可以减轻自由基引起的损伤，提高NO的生物利用度，在氧化应激的动物模型中发挥有益的作用[9]。本研究中，Tempol可抑制IH小鼠主动脉中ROS水平，提高NO浓度，显著改善IH小鼠血管内皮依赖性舒张功能和心肌肥大。Troncos et al[10]也发现，Tempol可明显降低间歇性低氧模型大鼠的血压、血浆内皮素和血管内ROS水平，提示ROS在IH诱发的心血管疾病中起着重要作用。

血管内皮细胞是连续覆盖于血管腔表面的单层上皮细胞，是多种血管活性物质的产生和作用部位，在维持血管张力、参与管壁炎症修复、调节血管生长以及调控血小板聚集和凝血功能等方面起着重要作用。内皮细胞可通过产生的NO，促进局部血管舒张，抑制血小板聚集、单核细胞黏附和血管平滑肌增殖来维持血管正常的形态和功能。内皮功能障碍被认为是心血管疾病发展过程中最早可检测到的和可能被逆转的异常之一。内皮功能障碍通常指的是内皮依赖性血管舒张功能受损，与NO生物利用度降低有关；而非内皮依赖性血管舒张功能受损，则表示与血管壁中的平滑肌功能障碍有关的进一步的结构损伤。慢性IH可通过氧化应激、一氧化氮利用不足、全身炎性反应、交感神经过度激活和内皮修复能力降低等途径导致血管内皮功能障碍能，进而增加高血压等心血管疾病的发生风险,可能是引起间歇性小鼠心肌肥大的机制之一。本研究显示，IH小鼠胸主动脉对ACh引起的内皮依赖性舒张功能下降，而对SNP引起的非内皮依赖性舒张功能正常，提示血管内皮功能受损可能是IH引起心血管疾病的重要原因之一，具体机制有待进一步研究。