烟草黑胫病菌胶体金免疫层析快速检测技术的建立与评价

杨 洋，羊国根，杨懿德，许大凤，崔权仁，李林秋，鄢 敏，周本国*，潘月敏

(1.四川省烟草公司宜宾市公司，四川宜宾 644600；2.安徽农业大学植物保护学院，安徽合肥 230036；3.安徽省农业科学院烟草研究所，安徽合肥 230031)

由烟草疫霉()引起的烟草黑胫病是烟草生产上最主要的病害之一，主要危害烟草的茎基部和根，严重时导致植株死亡。我国各烟区除黑龙江外均有发生，其中西南烟叶产区发病较重，每年因烟草黑胫病引起的经济损失超过1.2亿元。近年来，烟草黑胫病发病率有加重趋势，烟草黑胫病的控制主要依赖于化学防治，长期过量使用化学杀菌剂，导致农药残留量超标和抗药性菌株产生。因此，推广烟草黑胫病的绿色防控技术，减少化学农药使用量，保障烟叶绿色安全生产，烟草黑胫病的快速诊断是关键。

烟草黑胫病的传统检测依赖于病原菌的分离和田间症状观察，而随着分子生物学技术的快速发展，相继出现了基于核酸的检测体系，如常规PCR、多重PCR、荧光定量PCR和环介导等温扩增技术等，提高了烟草黑胫病的诊断效率。胶体金免疫层析技术是1990年由Beggs等建立的一种用来检测人尿和血清中HCG的技术，胶体金免疫层析技术具有操作简单、检测时间短、特异性强等特点，且不需要特殊仪器设备。目前，胶体金免疫层析技术被广泛应用于食品安全、动物传染病、人畜共患病、植物病害、农药残留和重金属离子等方面的快速检测。利用胶体金免疫层析试纸条能够快速、准确检测茶叶中草甘膦含量；以金黄色葡萄球菌菌体抗原免疫家兔获得多克隆抗血清，胶体金免疫层析技术可以快速检测金黄色葡萄球菌。利用马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)的兔多克隆抗体，研制的胶体金试纸条可用于PVX和PVY的快速检测，且灵敏度高、无交叉反应。

为建立高效、准确、便携的烟草黑胫病菌现场检测技术，笔者以烟草黑胫病菌为抗原制备单克隆抗体，以胶体金为标记材料研制胶体金免疫层析检测卡，用于烟草黑胫病菌的现场检测，旨在建立免疫胶体金层析检测技术，可实现烟草黑胫病菌早期诊断和病害监测，对烟草黑胫病的早期预防具有重大意义。

1 材料与方法

供试菌株：烟草疫霉()，安徽农业大学植物保护学院保存。供试土样：四川省宜宾市烤烟产区健康烟草根际土壤、烟草黑胫病病株根际土壤，每份约50 g，放入无菌样品袋，于4 ℃保存备用。10%V8 培养基：取去离子水800 mL，分别加入100 mL V8 汁，CaCO0.2 g，琼脂粉15 g，定容至1 L。试剂及仪器：牛血清白蛋白BSA、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；其他试剂均为国产分析纯。ST3100型pH计，奥豪斯仪器(上海)有限公司；恒温培养振荡器ZWY-2102C，上海智城分析仪器制造有限公司；台式划膜喷金机HGS510，杭州峰航科技有限公司。

单克隆抗体的制备。取6周龄雌性BALB/c小鼠4只进行免疫，共进行3次免疫，采取皮下多点注射，其中抗原免疫用量为25 μg。初次免疫用等量弗氏完全佐剂乳化，第二次免疫用等量弗氏不完全佐剂乳化，第三次免疫用等量生理盐水混合，腹腔注射。第二次免疫后10 d尾静脉采血，通过间接法测定抗体效价。

采用有限稀释法将细胞悬液连续稀释至统计上每孔加样仅含单个细胞，转移至96孔板培养，经过数次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100%时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将获得的阳性杂交瘤细胞在细胞培养瓶中扩大培养，而后冻存及制备腹水等。

将腹水离心15 min(4 000 r/min，室温)，取上清，在4 ℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30 min，离心30 min(13 000 r/min，4 ℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)；在4 ℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33%，继续搅拌30 min，离心30 min(13 000 r/min，4 ℃)，弃上清；沉淀溶于适量PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)，4 ℃透析过夜，测定抗体含量，-20 ℃冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用Protein G小柱进行纯化，新柱子先用5 mL超纯水过柱，再用5 mL 0.4 mol/L PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好地结合在结合位点上；继续10 mL 0.4 mol/L PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；5 mL 0.1 mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.7)洗脱结合位点上的抗体，并加入1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。

抗体配对筛选。配对筛选应用双抗夹心的ELISA方法对制备得到的抗体进行筛选，筛选出可以配对的抗体对。

双抗夹心的ELISA：用包膜缓冲液将包被抗体稀释至10 μg/mL，每孔100 μL，37 ℃包被3 h；洗板3～5次，每孔100 μL，25 ℃反应45 min；洗板3～5次，加入酶标抗体，每孔100 μL，25 ℃反应45 min；洗板3～5次，加入显色剂，25 ℃避光反应15 min；加入100 μL终止液，测定OD。

单抗与单抗配对筛选：将单抗作为包被抗体，另一个单抗标记HRP之后作为检测抗体，应用双抗夹心的ELISA方法进行配对筛选。

抗体标记HRP：2 mg HRP溶于纯水，加入高碘酸钠，室温反应30 min；将5 mg抗体用偶联缓冲液透析过夜；将HRP加入抗体溶液中，室温反应2 h；加入硼氢化钠封闭反应位点；磷酸盐缓冲液透析过夜，加入等量甘油保存于-20 ℃。

胶体金试纸的制备。

胶体金制备。取超纯水于烧杯中，加入烧金溶液A，置于恒温磁力搅拌器上搅拌混匀，开启加热至溶液沸腾，迅速加入新制备的烧金溶液B，继续搅拌加热，溶液逐渐变为蓝黑色，然后紫黑，再加热出现红色，继续沸煮出现透明的橙红色，继续沸煮7～10 min，自然冷却至室温，加超纯水定容。倒入棕色瓶，4 ℃避光保存。

胶体金标记抗体。取1.5 mL胶体金，用0.1 mol/L的KCO调节pH，加入相应量抗体，混合均匀，室温反应40 min。加入10%的BSA终止反应，静置30 min。1 500 r/min离心，弃凝聚的金胶粒形成的沉淀，8 500 r/min离心30 min，弃上清，沉淀物用金标液复溶，4 ℃保存。

喷金与划膜。将包被抗原稀释至适当浓度划于T线，羊抗鼠二抗划于C线，烘干待用；标记好的胶体金喷于预处理过的金标垫，烘干待用。

组装与测试。按图1所示将速测试纸各个组分组装，并检测配对效果，不用编号的金标垫与膜两两组合，检测配对效果。

注：1.底板；2.NC膜；3.吸水纸；4.金标垫；5.样品垫；6.T线；7.C线 Note：1.Bottom plate；2.NC membrane；3.Absorbent paper；4.Gold standard pad；5.Sample pad；6.T line；7.C line图1 胶体金试纸条组装Fig.1 Assembling of colloidal gold test strip

试纸条灵敏度检测。将烟草黑胫病菌菌丝分别稀释为10、100、1 000倍的溶液，分别用试纸条进行检测，每个处理重复3次。

田间样品测试。将从四川省宜宾市采集的烟草样本利用胶体金测速卡进行检测。

烟草黑胫病菌胶体金速测卡定量检测体系。将阳性样品(10 μg/mL)梯度稀释后用金标速测卡进行检测，同时用呈色分析仪读取C、T线深度值，重复3组，计算T/C的平均值，建立线性回归方程。

2 结果与分析

以烟草疫霉的菌丝和孢子作为抗原，小鼠经4次免疫后，共获得24个细胞株，纯化后的抗体亚型主要为IgG1，其中单抗15和单抗24的抗体亚型为IgM；有22个抗体的效价达1∶128 000及以上，而单抗1和单抗15效价较低为1∶64 000。表明烟草黑胫病菌的单克隆抗体已制备成功，可用于后续抗体配对及胶体金免疫层析速测卡的研制(表1)。

表1 单克隆抗体亚型和效价Table 1 Antibody subtypes and titers

选择13个烟草黑胫病菌的单克隆抗体进行抗体两两配对筛选，判断能否形成稳定的双抗体夹心结构。抗体配对筛选结果表明，金标单抗6配对划膜单抗18，金标单抗16配对划膜单抗14和18，金标单抗19配对划膜单抗18，金标单抗22配对划膜单抗12和单抗18均有明显的阳性反应(较强阳性和强阳性反应)，筛选出能够形成稳定的双抗体夹心结构的抗体配对，可用于胶体金免疫层析试纸条的研制(表2和图2)。

表2 抗体配对筛选Table 2 Antibody pairs screening

图2 抗体配对筛选Fig.2 Antibody pairs screening

根据抗体配对筛选结果，选择金标单抗6配对划膜单抗18组装胶体金免疫层析速测卡，用于检测菌丝样品，稀释100倍后肉眼仍能够在T线上看到显色反应，而稀释1 000倍后T线未呈现显色反应，表明金标单抗6配对划膜单抗18的最低检测抗原浓度为0.1 μg/mL，有较高的检测灵敏度(图3)。

图3 烟草黑胫病菌胶体金免疫层析速测卡的灵敏度Fig.3 Sensitivity of colloidal gold rapid detection card for Phytophthora nicotianae

为明确烟草黑胫病菌胶体金速测卡现场检测效果，从田间采集健康烟株和发病植株进行检测。所研制的烟草黑胫病菌胶体金速测卡能够检测出菌丝样品和烟草黑胫病病根，T线呈现显色反应，而对健康根、赤星病病叶和根黑腐病病根在T线未呈现显色反应，表明烟草黑胫病菌胶体金速测卡特异性较高，可在田间实现黑胫病的早期检测(图4)。

图4 烟草黑胫病菌胶体金免疫速测卡田间样本检测Fig.4 Detection of field samples by colloidal gold rapid detection card of Phytophthora nicotianae

同时，从田间采集10份发病材料，利用烟草黑胫病菌胶体金速测卡进行检测，其中室内分离到的黑胫病菌和尖孢镰刀菌分别是5和3份，胶体金速测卡检出黑胫病菌7份，常规PCR检出黑胫病菌9份。胶体金速测卡检出率略低于PCR，但高于室内分离纯化鉴定(表3)。

表3 田间发病样品检测Table 3 Detection of diseased tobacco

利用呈色分析仪分别读取反应5、8、10 min后C线和T线深度值，并计算T/C，其T/C在5、8、10 min差异不大，因此最佳检测时间可以选择5 min(表4)。以稀释倍数(即浓度的倒数)为横坐标，T/C为纵坐标，得出标准曲线=-0049 5+1279 3(=0972 6)，可用于定量检测样品中的烟草黑胫病菌数量(图5)。

表4 烟草黑胫病菌胶体金免疫层析速测卡T/C比值Table 4 The T/C ratio of colloidal gold rapid detection card for Phytophthora nicotianae

图5 烟草黑胫病菌胶体金免疫层析速测卡定量检测标准曲线Fig.5 Standard curve for quantitative detection of Phytophthora nicotianae with colloidal gold rapid detection card

3 结论与讨论

烟草黑胫病是我国西南烟区主要的根茎类病害，烟草黑胫病的防治应采取“预防为主，综合防治”的策略，烟草黑胫病的早期监测是有效控制该病害的重要前提。

目前，基于聚合酶链式反应(PCR)快速诊断已在植物病害检测中广泛应用，包括常规PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR，然而存在检测时间长、价格相对昂贵，且需要特殊的仪器设备和熟练的技术人员等方面的不足。近年来，又开发出多种基于核酸扩增的等温快速检测技术，如环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)和重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)，已广泛应用于植物病原菌的快速检测，然而这2种技术都容易出现假阳性。

胶体金免疫层析技术具有简单、快速、准确和无污染等优点，是以胶体金为示踪标记物，与抗原抗体特异性反应相结合的免疫分析技术，现已广泛应用于医学检验、食品检测和病原物检测等领域，可实现定性、半定量以及定量检测。胶体金免疫层析技术应用于植物病原物的现场快速检测，如以番茄环纹斑点病毒(TZSV)的核壳体蛋白为抗原，建立的胶体金免疫层析检测技术，检测方便、快速、特异性强，其检测下限是TZSV感染叶片的800倍稀释液；以水稻条纹病毒(RSV)的病毒粒子为抗原制备单克隆抗体，建立的RSV胶体金免疫层析试纸条，特异性检测水稻和灰飞虱中是否存在RSV，其灵敏度达 1∶20 480；以尖孢镰刀菌一个65 kD蛋白为检测靶标建立的胶体金免疫层析技术，其敏感性、特异性和准确性分别为92.59%、81.25%和90.00%，对染病根茎的检测下限为2.122 μg/mL抗原，检测时间只需要5 min。

该试验使用烟草黑胫病菌的菌丝和孢囊孢子为抗原，制备单克隆抗体，研制烟草黑胫病菌胶体金免疫层析速测卡。所建立的烟草黑胫病菌胶体金免疫层析技术，其最大的优点是简便、快速、不需要特殊的检测仪器，通常只需5～10 min即可完成检测；灵敏度高，其检测下限为0.1 μg/mL抗原，能够特异性检测烟草黑胫病菌，没有交叉反应，可应用于烟草黑胫病田间快速准确诊断，有较好的推广和应用价值。