不同激素对杜鹃愈伤组织诱导及增殖的影响

张华纬

(长治学院 生命科学系，山西长治 046011)

杜鹃主要用作观赏、边坡绿化、切花瓶插等。然而，由于季节和极端天气影响，杜鹃种子在自然环境条件下生根困难，难以实现快繁市场化，需寻找在短时间实现快速繁殖的方法。组织培养可以解决自然条件对杜鹃生长发育的限制，能够加快繁殖培育速度，实现短时间内规模化、商业化生产[1]。

本试验首先对杜鹃种子进行无菌组培获得无菌苗，之后在不同激素种类和浓度梯度条件下采用无菌苗叶片进行愈伤组织诱导培养，统计诱导率、观察成活情况；再利用已产生的愈伤组织，进一步进行增殖培养，并统计增殖率、增殖倍数等参数，以得出最合理的激素种类和浓度配比。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为杜鹃中两个品种，即露珠杜鹃（Rhododendronirroratum）、马缨杜鹃（Rhododendrondelavayi）种子，于2018年12月采集自云南昆明植物园，千粒重分别为0.072 3 g、0.297 9 g。

1.2 实验试剂

WPM培养基（不含糖和琼脂），北京康倍斯科技有限公司；R2A琼脂，北京奥博星公司；75%乙醇消毒液，太仓新太酒精有限公司；萘乙酸（NAA），泽叶生物科技有限公司；噻苯隆（TDZ），阿拉丁试剂（上海）有限公司；6-苄氨基嘌呤（6-BA），阿拉丁试剂（上海）有限公司；吲哚乙酸（IBA），山东鑫江化工有限公司；玉米素（ZT），山东鑫江化工有限公司。

1.3 仪器与设备

PHS-3C型pH计，上海何亦仪器仪表有限公司；ESJ-4/ESJ-4B系列电子天平，沈阳龙腾电子有限公司；LS-100HG立式灭菌锅，北京海富达科技有限公司；DY-Y6超净工作台，江苏东英实验设备有限公司。

1.4 试验设计

1.4.1 高山杜鹃种子无菌幼苗培育

配制好WPM培养基后，将露珠杜鹃、马缨杜鹃种子进行接种，每个品种各接种30个三角瓶；接种后放在干净的日光灯的培养架上，观察并记录其发芽数和生长状况，试验周期为60 d。

1.4.2 杜鹃愈伤组织诱导

以WPM为基本培养基，附加不同种类和浓度激素对无菌苗叶片愈伤组织进行诱导培养。激素浓度梯度如下。（1）0.5 mg/L NAA+TDZ0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L、0.7 mg/L 和1.0 mg/L，编号A1～A8；（2）0.5 mg/L NAA+6-BA 0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.9 mg/L、1.7 mg/L、2.5 mg/L 和5.0 mg/L，编号 B1～ B6；（3）0.5 mg/L IBA+6-BA 0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.9 mg/L、1.7 mg/L、2.5 mg/L 和5.0 mg/L，编号 C1～ C6；（4）5.0 mg/L 6-BA+IBA 0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.3 mg/L、0.4 mg/L 和0.5 mg/L，编号D1～D6[2]。每种激素组合均匀接种80个嫩叶片（16只三角瓶×5个嫩叶片），40 d后记录诱导结果。

1.4.3 杜鹃愈伤组织增殖培养

以WPM为基本培养基，选取规格一致的愈伤组织，对其进行增殖培养。设计激素种类、浓度如下：（1）0.5 mg/L NAA+TDZ0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L、0.7 mg/L和1.0 mg/L，编号E1～E6；（2）1.0 mg/L NAA+ZT0.0 mg/L、0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L、0.7 mg/L和1.0 mg/L，编号F1～F6。

每种激素组合接种60个外植体（15只三角瓶×4块愈伤组织），40 d后统计结果。

1.5 试验方法

1.5.1 杜鹃种子无菌幼苗培育

将三角瓶高压灭菌、清洗、晾晒备用；配制WPM基本培养基（1.5 L蒸馏水+4.17 g WPM固体，搅拌至固体完全溶解后添加45 g蔗糖），调试pH值为5.8，加入11.25 g琼脂，加热并搅拌至液体沸腾[3]；将配制好的培养液装瓶并进行高温灭菌2.5 h；超净工作台上紫外灭菌30 min，通风30 min；种子用酒精消毒30 s后，再用NaClO3消毒10 min；用镊子将种子均匀散布在三角瓶的培养基上封口培养。

1.5.2 杜鹃叶片愈伤组织诱导

配制好WPM培养基后，按设计使用量用移液枪将激素加入到培养液中（NAA、6-BA、IBA都是耐高温的激素，可在配制培养基的同时按设计使用量加入，并对其进行高温高压灭菌操作；对于不耐高温的TDZ，需要在培养液、枪、枪头等进行高温灭菌后，再将TDZ加入容量瓶中充分振荡并做好不同浓度TDZ的标记，再分装到的三角瓶中）；超净工作台用紫外杀菌并通风后，取露珠杜鹃种子产生的无菌苗嫩叶作为外植体，用75%乙醇涮洗3 min，再用5%青霉素溶液浸泡10 min，用无菌水冲洗并吸干，在无菌操作台上将其剪成3 mm×3 mm的正方小块，将叶面均匀划伤后接种到培养基上进行嫩叶愈伤组织诱导培养[4-5]。

1.5.3 杜鹃愈伤组织增殖

将叶诱导出的愈伤组织切成3 mm×3 mm的小块接入培养基。培养基配制及激素加入方法同1.5.1和1.5.2。

1.5.4 观测指标

本试验中需要研究的指标及其计算公式如下：

（1）种子发芽率=（发芽种数/未污染的总种数）×100%；

（2）诱导率=（发生愈伤组织的叶块数/接种的总叶块数）×100%；

（3）增殖倍数=愈伤组织增重总质量/接种时愈伤组织的总质量；

（4）增殖率=增殖的愈伤组织块数/接种时愈伤组织的总块数。

2 结果与分析

2.1 不同品种杜鹃种子产生无菌苗效果差异

不同品种杜鹃种子对组织培养产生无菌苗的适应能力是不同的。组培60 d发现，马缨杜鹃的株高平均为1.0 cm，露珠杜鹃为1.3 cm，之后每周株高大约会增长1.0 mm。当马缨杜鹃株高为2.0 cm，露珠杜鹃为2.5 cm 时，由于三角瓶容量及生长培养液量的限制，两种杜鹃株高基本不再变化。露珠杜鹃植株高度、叶面积以及发芽率均大于马缨杜鹃，且其污染率小于马缨杜鹃（见表1），由此可见，在本试验中露珠杜鹃更适合采用组培方法进行快速繁殖。因此后续试验将以露珠杜鹃种子为研究对象。

表1 两种杜鹃种子组织培养后污染率和发芽率的统计

2.2 杜鹃叶片愈伤组织诱导

2.2.1 NAA+TDZ

由表2可知，WPM+TDZ+NAA在总体上都可诱导露珠杜鹃产生愈伤组织，几乎不存在污染及褐化问题，这与王济红等[6]的研究成果相似。以NAA 0.5 mg/L为基本生长素，在其浓度不变的情况下，愈伤组织诱导率及组织生长状况与TDZ浓度变化密切相关。随着TDZ浓度的升高，诱导率呈现先上升后下降的趋势，TDZ浓度为0.20～0.50 mg/L时，诱导率较高、愈伤组织活力强、生长良好，质地松软适中，颜色呈现黄绿色。筛选出的最佳配方为WPM+0.4 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA，此配方下诱导率可达78.75%。

表2 NAA+TDZ对愈伤组织诱导的影响

2.2.2 NAA+6-BA

由表3可知，以NAA（0.5 mg/L）为基本生长素，在其浓度不变的情况下，WPM+6-BA+NAA对于杜鹃愈伤组织的诱导效果总体较差，最高诱导率只有27.50%。随着6-BA浓度的升高，诱导率先缓慢上升随后快速下降，当6-BA浓度升高至2.5 mg/L、5.0 mg/L，诱导率仅为8.75%、1.25%，甚至低于单独添加0.5 mg/L NAA的作用效果（13.75%），表明高浓度的6-BA反而会抑制NAA的作用效果；此外，6-BA浓度的升高会导致愈伤组织出现生长状况差、质地硬、黄黑色、褐化和污染现象较严重等问题。该试验结果表明，NAA+6-BA不适用于杜鹃组织培养，高浓度6-BA反而会抑制诱导，还会导致高污染现象。

表3 NAA+6-BA对愈伤组织诱导的影响

2.2.3 6-BA+IBA

由表4可知，在以0.5 mg/L IBA为基本生长素，且其浓度不变的情况下，WPM+IBA+6-BA对于杜鹃愈伤组织的诱导效果总体较差，大多数叶片发生了褐变现象，诱导率极小。0.5 mg/L IBA的单独作用效果（诱导率10%）优于6-BA加入后的效果。

表4 IBA+6-BA对愈伤组织诱导的影响

由表5可知，在以5.0 mg/L 6-BA为基本生长素，且其浓度不变的情况下，WPM+6-BA+IBA对于杜鹃愈伤组织的诱导效果为本次实验最差，诱导率仅为0.00%～3.75%。说明WPM+6-BA+IBA激素组合不适用于露珠杜鹃叶片愈伤组织的诱导。

表5 6-BA+IBA对愈伤组织诱导的影响

2.3 杜鹃愈伤组织增殖培养

2.3.1 NAA+TDZ

由表6可知，TDZ浓度在0.3～0.5 mg/L时愈伤组织增殖效果较好，增殖率和增殖倍数相对较高，增殖率达到了41.67%～68.33%，增殖倍数在0.95～1.98，愈伤组织活力相对较强。继续增加TDZ浓度至1.0 mg/L时，愈伤组织增殖速度减慢，增殖倍数显著降低。因此选用0.5 mg/L TDZ、配以基本生长素0.5 mg/L NAA对愈伤组织进行增殖培养为宜。

表6 TDZ和NAA对愈伤组织增殖的影响

2.3.2 NAA+ZT

由表7可知，在基本生长素1.0 mg/L NAA基础上，加入ZT浓度越高，增殖率越低，增殖倍数逐级下降，越不利于愈伤组织增殖。表明WPM+ZT+NAA组合不利于露珠杜鹃愈伤组织增殖。

表7 ZT和NAA对愈伤组织增殖的影响

3 结论

（1）马缨杜鹃和露珠杜鹃的种子在组培中可实现较快发芽。露珠杜鹃种子发芽率（88.17%）、苗高及叶面积均大于马缨杜鹃种子发芽率，且其污染率（6.1%）小于马缨杜鹃（11.62%）。

（2）露珠杜鹃叶片愈伤组织的诱导试验结果表明：使用TDZ+NAA组合使愈伤组织的诱导率较6-BA+NAA及6-BA+IBA的诱导率高；高浓度水平的6-BA在总体上不利于愈伤组织的诱导，会出现愈伤组织生长状况差、褐化现象和污染现象较严重等问题；IBA在任何浓度梯度下都不利于愈伤组织的诱导。露珠杜鹃叶片诱导产生愈伤组织的最佳配方为WPM+0.4 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA，愈伤组织诱导率可达78.75%。

（3）露珠杜鹃愈伤组织增殖试验结果表明：WPM+ZT+NAA不同浓度激素配比的增殖效果差别较大，在基本生长素1.0 mg/L NAA基础上，加入ZT浓度越高，越不利于愈伤组织增殖，总体上增殖效果不如TDZ+NAA。愈伤组织增殖的最佳培养基配方为WPM+0.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA，愈伤组织增殖率可达68.33%。