5种抗病毒药物对新城疫的治疗效果研究

刘思喜，夏 伟，张 浩，王友娟，刘 芳，李勤芳，吴 林

（青岛中仁动物药品有限公司，山东 胶州 266300）

新城疫又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由新城疫病毒引起的一种高度接触性禽类烈性传染病[1]。病毒存在于病禽的所有组织器官、体液、分泌物和排泄中，以脑、脾、肺含毒量最高。鸡群发病后不表现出典型的临床症状和病理变化，无季节性，无品种差异[2]。鸡群发病初期以呼吸道症状为主，后期主要表现为神经功能紊乱、出血等[3]。

新城疫尚无有效治疗药物，只能依靠严格消毒、隔离和用疫苗接种预防[4]。近年来，各地各有关部门按照国家总体部署，坚持预防为主，切实落实免疫、监测、扑杀、消毒、无害化处理等各项综合防治措施，加大防控工作力度，疫情发生几率明显下降，感染率总体维持在较低水平，全国防控工作取得显著成效。但局部地区病毒污染比较严重，疫情呈持续性地方流行。

目前市面上常用的用于治疗新城疫的药物主要有中草药类（板青颗粒类[5]、双黄连可溶性粉）、中药多糖类[6]（黄芪多糖、香菇多糖、浒苔多糖）、生物制品类（干扰素[7]、核酸类[8]），公司现有的药物中主要有 5种，分别为板青颗粒、浒苔多糖、30 % α干扰素 + 30 % β干扰素 +40 % β白细胞介素、免疫核酸、核酸糖肽，对这5种药物的治疗效果进行了试验效果评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物样品 1、2、3、4、5号共 5种抗病毒药物，分别对应板青颗粒、浒苔多糖、30 % α干扰素 + 30 % β干扰素 + 40 % β白细胞介素、免疫核酸、核酸糖肽 5种药物，药物样品处理见下表 1。用药期间每个试验组的饮水、采食、给药均是独立的系统，饮水喂药期间全天饮水给药，上午和下午及晚间更换 3次新配置的药，连用5 d，鸡群自由饮水。

表1 药物样品 （ml）

1.1.2 血凝与血凝抑制试验用试剂 1 % 鸡红细胞悬液，新城疫病毒（尿囊液），新城疫阳性血清，待检鸡血清。

1.1.3 试验动物及病毒 （1）试验动物。21日龄SPF鸡，购自济南斯帕法斯家禽有限公司，试验期间笼养，按饲养规程进行日常管理，自由采食、饮水。（2）试验用病毒。新城疫病毒为本实验室保存，攻毒前经SPF胚传代1次。

1.1.4 仪器设备 SPF鸡饲养隔离器及配套设施、肉鸡饲养设施（鸡笼、料槽、饮水器、清扫设备等）、小台称、超净工作台、离心机、高压锅、孵化箱、微量移液器、微型振荡器、96孔V型微量反应板等。

1.2 方法

1.2.1 毒株复壮及EID50测定 试验用NDV毒株经尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚，每胚0.2 ml，37 ℃培养，48 h后收集尿囊液，用于下一步试验。

用无菌生理盐水将收获的病毒尿囊液做 10倍系列稀释，每个稀释度接种5枚9日龄SPF鸡胚，每胚接种0.2 ml，置于37 ℃ 下孵化4 d，观察记录鸡胚死亡情况，弃掉24 h内死亡的鸡胚。收获尿囊液后用血凝试验检测鸡胚的感染情况，按Reed-Muench方法计算EID50值。

1.2.2 攻毒试验 取 15只 SPF鸡，分成 3组，每组5只，分别以105EID50、104EID50、103EID50（标记为 N1组、N2组、N3组）的剂量，通过滴鼻的方式攻毒进行预试验，每天做好发病死亡情况的记录，计算发病率和死亡率。

1.2.3 试验动物分组 试验选取 21日龄 SPF鸡56只，随机分为7组，每组8只鸡。根据攻毒毒株 EID50和预试验结果，确定攻毒剂量为104EID50，采用滴鼻的方式进行攻毒。攻毒后，每天做好死亡记录，计算死亡率和保护率。具体分组和处理方式见表2。

表2 SPF鸡试验分组与处理

1.2.4 测定指标与测定方法 （1）保护率测定。每天详细记录各组鸡只死亡情况。解剖死亡的鸡只，观察感染后临床症状。测定死亡率和保护率。（2）鸡只日增重情况。每天空腹称重 1次，计算日增重。（3）新城疫抗体检测。对照组及所有用药组在攻毒前及攻毒第 5天、第 10天、第 14天，每组随机抽取 3只鸡，每只鸡静脉采血 0.5 ml，注入洁净离心管内，3 000 rpm/min离心 5 min，吸出血清保存于 -20 ℃ 下备用。采用血凝及血凝抑制试验的方法检测新城疫抗体，使用抗原为攻毒毒株。（4）统计分析。试验数据采用 Excel进行处理后，采用 SPSS 20.0统计软件进行比较分析，得出试验药品对试验鸡体重、抗体水平、保护率的数据。

2 结果

2.1 毒株EID50

病毒作 10倍系列梯度稀释后接种鸡胚的感染情况如表 3，经过计算可得攻毒毒株的EID50/0.2 ml=10-5.83，即该病毒作 10-5.83稀释，接种0.2 ml能使半数鸡胚感染。

表3 攻毒毒株EID50的计算

距离比例=（高于 50 % 的死亡分数 -50 %）/（高于 50 % 的死亡百分数-低于 50 %的死亡百分数）=（100 %-50 %）/（100 %-40 %）=0.83，EID50的对数=高于 50 % 病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数 =-5+0.83×（-1）= -5.83，则 EID50=10-5.83，0.2 ml。

2.2 攻毒量确定

结果显示，N1组的5只SPF鸡在第5天的时候全部死亡，而N3组的5只鸡到攻毒后第7天仅出现1只死亡，故确定N2组的104EID50的攻毒剂量作为正式试验的攻毒量。

图1 不同攻毒剂量鸡只存活情况

2.3 临床症状和保护率

攻毒对照组和用药组SPF鸡在第3天开始出现明显症状，羽毛脏乱堆挤在一起，精神萎靡不振，饲料用量、饮水量减少；卧伏于笼中，不爱走动，后期双翅麻痹、下垂；排黄绿色及黄白色稀便。攻毒对照组在 5 d时鸡只开始陆续出现死亡，用药组A-D的鸡只也陆续出现死亡；而用药组E在5 d鸡死亡1只后，随后就没有出现鸡死亡现象，一直保持稳定，精神状态也在逐渐好转。试验期鸡只存活情况如表4、图2。

图2 试验期鸡只存活情况

表4 各试验组鸡只存活情况及保护率

空白对照组SPF鸡未出现任何的临床症状，精神正常，体重逐步增加，食欲和饮欲良好。

剖检病死鸡可见：羽毛脏乱、消瘦，肛门周围被排泄物污染。剖检可见鼻腔和气管内有黏液，气管黏膜水肿出血，肺脏出血；腺胃乳头出血，十二指肠出血，小肠黏膜出血，胰腺出血；肾脏肿大出血，输尿管有尿酸盐沉积。部分剖检病变如图3。空白对照组的鸡解剖无病变。

图3 攻毒组死亡鸡剖检结果

2.4 体重变化

攻毒对照组与各用药组在攻毒后第 2天开始出现体重下降，之后体重不断下降，各组体重变化趋势基本一致（除用药组 E外）。由于各组鸡只死亡情况有异，故体重数据的采集天数有所不同，其中用药组B的体重数据采集到第8天，用药E组采集到第10天，其他各组在第6~8天的时候鸡只死亡较多，无法采集有效数据。

饲喂5号药品的用药组E表现出了良好的治疗效果，只死亡了 1只鸡，随后鸡的精神状态开始恢复，采食量增加，体重回升。

试验期间，空白对照组的鸡只体重保持上升趋势。

2.5 抗体水平变化

对照组及所有用药组在攻毒前及攻毒第 5天、第10天、第14天，每组随机抽取3只鸡，采用血凝及血凝抑制试验的方法检测新城疫抗体，结果如表5。

表5 NDV抗体检测结果（log2）

结果显示，所有SPF鸡在攻毒前均无新城疫抗体，攻毒第 5天开始产生抗体，抗体水平很低。随后攻毒组、用药组 A-D出现鸡只大量死亡，到第 10天已无鸡只存活，未能持续监测抗体；而用药组E鸡只存活率很高，抗体水平在第10天、14天检测中逐渐升高，显示了很好的保护效果。

空白对照组一直无新城疫抗体。

3 讨论

（1）攻毒后，鸡只体重都开始呈现下降趋势，各组鸡只死亡有差异，用药 C组只采集了6 d的数据，用药E组则采集了10 d的数据，其他各组在 6~8 d出现死亡较多，无法采集全面数据，因此各组的数据采集无法保持同步，出现了一定的差异。

（2）10 d后只有药物组 E有较多鸡只存活，其他组鸡只已经全部死亡，没有抗体数据可以体现。

（3）本试验中核酸糖肽在新城疫治疗方面显示了良好的治疗效果，死亡率低，有效保护率达到了75 %，体重也逐渐恢复到正常标准，抗体水平逐渐升高。而板青颗粒、浒苔多糖、30 % α干扰素 + 30 % β干扰素 + 40 % β白细胞介素、免疫核酸在本次试验中并未体现出理想的治疗效果，可能跟表达的新城疫抗体水平不高有关系，需要进一步开展研究。