1 株羊源溶血性曼氏杆菌的分离鉴定、药敏试验及致病性研究

宋 越，王 娜，张 帆，张月梅，戴伶俐，白 帆，李晓艳，格根宝乐日，刘双翼，王根云，赵世华

（1. 内蒙古自治区农牧业科学院， 内蒙古 呼和浩特 010031；2. 呼和浩特市动物疫病防控中心， 内蒙古 呼和浩特 010020）

近年来， 随着我国养殖业规模化水平的不断提高，家畜养殖密度不断增加，由溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）引起的动物呼吸道疾病发病率不断升高［1］。 溶血性曼氏杆菌原名为溶血性巴氏杆菌，为巴氏杆菌科曼氏杆菌属成员［2］。 溶血性曼氏杆菌是引起牛、 羊等反刍动物呼吸道疾病的重要细菌性病原之一［3］。 溶血性曼氏杆菌属于条件性致病菌， 当家畜机体受到应激或病原体侵袭导致免疫力下降时在体内增殖。 在现有已定名的5 种曼氏杆菌中溶血性曼氏杆菌的致病性最强，而且是唯一能够发酵L-阿拉伯糖的革兰阴性菌［4］。 溶血性曼氏杆菌共有12 个血清型，在羊呼吸道中以A1 和A2 型最常见。 溶血性曼氏杆菌为两端钝圆、有荚膜的革兰阴性短杆菌［5-6］。 绵羊与山羊感染溶血性曼氏杆菌可造成不定期的暴发性肺炎［7］。 目前，国内外对溶血性曼氏杆菌引起的绵羊和山羊发病、死亡病例报道较多［8-9］，可见溶血性曼氏杆菌是在世界范围内具有较大危害性的羊呼吸道病原菌。 该研究通过对从某养殖场采集的发病山羊呼吸道组织临床样本进行细菌分离鉴定、药敏试验及致病性分析，确定造成该养殖场发生羊只死亡的致病菌， 通过药敏试验为指导临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

致病性试验所用羔羊为2 月龄萨能奶山羊3只，购自内蒙古呼和浩特市某养殖场。

1.2 病料来源

某养殖场发病山羊， 临床表现为鼻腔内有脓性分泌物，由于呼吸困难造成死亡，现场剖检后采集气管及肺脏组织。

1.3 主要试剂

TSA 固体培养基、TSB 液体培养基、细菌生化鉴定管， 购自广东环凯微生物科技有限公司；马血清，购自北京索莱宝科技有限公司；细菌全基因组DNA 提取试剂盒， 购自天根生化科技 （北京） 有限公司；Trans2K Plus ⅡDNA Marker、2×EasyTaq PCR SuperMix， 购自北京全氏金生物技术有限公司。 左氧氟沙星、土霉素、环丙沙星、替米考星、阿奇霉素、庆大霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、泰乐菌素标准品均购自中国食品药品检定研究院。

1.4 主要仪器设备

生物安全柜（型号：AC2-4S1），新加坡艺斯高有限责任公司产品；生化培养箱（型号：C18-90），上海申光仪器仪表有限公司产品； 恒温摇床 （型号：TS-2112B）， 上海比朗仪器制造有限责任公司产品；高速离心机（型号：pico17），赛默飞世尔科技（中国） 有限责任公司产品； 恒温金属浴（型号：CHB-T2）， 杭州博日科技有限公司产品；PCR 仪（型号：ABI9902）、电泳仪（型号：HE99X）、全自动凝胶成像仪（型号：TypeT2A），美国伯乐有限责任公司产品；恒温水浴锅（型号：SH-WB-6GDN3），韩国三兴有限责任公司产品；旋涡振荡器（型号：VM-10），大韩科学有限公司产品。

1.5 病原菌分离鉴定

1.5.1 病原菌分离

在无菌条件下，酒精擦拭消毒样品表面，使用无菌剪子、镊子小心剪开样品表面，选取病变交界处组织用无菌镊子取出后涂布于TSA 固体培养基，于培养箱内37 ℃培养24 h。

1.5.2 病原菌表型鉴定

1.5.2.1 革兰染色镜检

对分离到的菌株纯化培养3 次， 过夜培养后从平板上选取单菌落进行革兰染色镜检， 若镜检时镜下视野内细菌单一， 则挑取该菌落接种于TSB 液体培养基， 于恒温摇床37 ℃过夜培养，冻存菌液。

1.5.2.2 生化鉴定

使用一次性接种环挑取经纯化培养的分离菌株，接种至生化反应管，具体操作按照生化鉴定管说明书， 接种后放置于生化培养箱内37 ℃培养24～48 h，判定生化反应结果。

1.5.3 病原菌分子生物学鉴定

1.5.3.1 基因组DNA 提取

吸取培养24 h 的菌液1 mL，12 000 r/min 离心2 min，弃上清液，后续步骤参照细菌全基因组DNA 提取试剂盒说明书操作。

1.5.3.2 细菌16S rDNA 扩增及测序

使用细菌16S rDNA 通用引物进行PCR 扩增，上游引物（27F）序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物（1492R）序列：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，目的片段预期大小为1 500 bp。 PCR 扩 增 反 应 体 系 为50 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，ddH2O 21 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板2 μL； 阴性对照反应体系内模版为ddH2O， 阳性对照反应体系内模版为已经鉴定过的溶血性曼氏杆菌基因组DNA。 PCR反应结束后， 吸取5 μL 扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，剩余产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.5.3.3 系统进化树构建及同源性分析

将测序获得的序列登录NCBI 网站， 利用BLAST 模块进行序列比对， 在获得分离菌株同源性比对信息的同时， 下载大肠杆菌（Escherichia coli）、马链球菌（Streptococcus equi）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）、 溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）菌株的16S rDNA 序列，对分离菌株的16S rDNA 序列使用MegAlign 8.0 软件构建系统进化树并进行同源性分析。

1.6 药敏试验

依据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2013 年发布的《动物源细菌抗菌药物敏感性试验纸片法与稀释法执行标准》（VET01-A4）进行药敏试验及敏感性判定。将左氧氟沙星、土霉素、环丙沙星、替米考星、阿奇霉素、庆大霉素、恩诺沙星、氟苯尼考、泰乐菌素用TSB 液体培养基以5 120 μg/mL 为起始浓度进行系列倍比稀释。采用微量肉汤稀释法，于96 孔细胞培养板内， 第1～11 孔按照浓度由高到低的顺序加入50 μL 稀释药液，并在第12 孔加入MH 液体培养基作为阴性对照。 将培养24 h 的羊源溶血性曼氏杆菌分离株菌悬液用MH 液体培养基稀释至浓度约为1×106CFU/mL， 分别加入第1～11 孔，每孔100 μL。加样完毕后加盖振荡1 min，封口膜密封后置于培养箱内37 ℃培养24 h，观察结果。 在培养后的细胞培养板中加入5 g/mL 的红四氮唑（TTC）溶液5 μL/孔，置于37 ℃培养1～2 h，观察结果。 加入TTC 溶液是为准确判断最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值，当孔内不显示红色时即为细菌生长的MIC 值［5］。

1.7 致病性试验

于TSB 液体培养基内复苏冻存的羊源溶血性曼氏杆菌分离株，经3 次传代后，将处于对数生长期的菌液稀释至浓度约为1×106CFU/mL， 经气管攻毒2 月龄奶山羊，接种量为0.2 mL/只。 观察72 h内羔羊发病情况， 对死亡羔羊进行病理剖检及细菌分离鉴定，方法同上。

2 结果与分析

2.1 细菌分离及表型鉴定

2.1.1 革兰染色镜检

从病料中分离出1 株疑似为溶血性曼氏杆菌的菌株，将其编号为DMQ-Y-Mh。 该菌株在TSA固体培养基上生长状态良好，为针尖大小的圆形、半透明菌落，表面湿润、光滑。 镜检观察发现细菌有荚膜，呈现两端钝圆、单个或者散在排列的革兰阴性短杆菌。 结果见图1、图2。

图1 DMQ-Y-Mh 菌株在TSA 固体培养基上的生长情况

图2 DMQ-Y-Mh 菌株革兰染色镜检结果（1 000×）

2.1.2 生化鉴定

常用于曼氏杆菌鉴定的生化反应项目有葡萄糖、乳糖、麦芽糖、L-阿拉伯糖、甘露糖等糖类，以及甘露醇、氧化酶、触酶、脲酶等。按照生化鉴定反应管说明书判定结果，结果见表1。 如表1 所示，DMQ-Y-Mh 菌株分解乳糖试验、分解葡萄糖试验、分解麦芽糖试验、分解L-阿拉伯糖试验、分解甘露醇试验、 氧化酶试验以及触酶试验结果均为阳性；分解甘露糖试验与脲酶试验结果为阴性。该菌株的生化反应特征与溶血性曼氏杆菌基本相符。

表1 DMQ-Y-Mh 菌株生化反应试验结果

2.2 细菌分子生物学鉴定

以DMQ-Y-Mh 菌株的基因组DNA 为模版，利用细菌16S rDNA 通用引物进行PCR 扩增，对获得的扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。由图3 可知，扩增产物片段大小在1 500 bp 左右，与预期相符。 将测序所得序列提交至NCBI 进行比对， 发现DMQ-Y-Mh 菌株与溶血性曼氏杆菌的16S rDNA 序列相似度最高。 构建的系统进化树显示，DMQ-Y-Mh 菌株与GenBank 中公布的溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）MF417605.1 株亲缘关系最近，16S rDNA 序列相似度达到100%（见图4、图5）。

图3 DMQ-Y-Mh 菌株16S rDNA PCR 扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳检测结果

图4 基于16S rDNA 序列构建的DMQ-Y-Mh 菌株系统进化树

图5 基于16S rDNA 序列的DMQ-Y-Mh 菌株同源性分析

2.3 药敏试验

9 种抗菌药物对DMQ-Y-Mh 菌株的MIC 测定结果见表2。 如表2 所示， 不同抗菌药物对DMQ-Y-Mh 菌株的MIC 测定结果分别为：左氧氟沙星1.25 μg/mL， 土霉素5.00 μg/mL， 环丙沙星0.16 μg/mL， 替米考星40.00 μg/mL， 阿奇霉素2.50 μg/mL， 庆大霉素0.36 μg/mL， 恩诺沙星40.00 μg/mL， 氟苯尼考2.50 μg/mL， 泰乐菌素640.00 μg/mL。 根 据CLSI 药 敏 试 验 判 定 标 准，DMQ-Y-Mh 菌株对环丙沙星、阿奇霉素、庆大霉素敏感，对左氧氟沙星、土霉素、氟苯尼考中度敏感，对替米考星、恩诺沙星、泰乐菌素耐药。

表2 抗菌药物对DMQ-Y-Mh 菌株的MIC 测定及敏感性判定结果 单位：μg/mL

2.4 致病性试验

接种DMQ-Y-Mh 菌株初期可见羔羊采食量下降，被毛粗乱，精神沉郁以及呼吸不畅。 随着接种时间的延长，羔羊表现出体温升高、流鼻涕、眼周出现大量分泌物、呼吸急促等现象；随着病程的发展羔羊死亡。 剖检时眼观气管及肺支气管内有黏性分泌物，肺脏组织有深红色病灶，与正常肺脏组织界限明显（见图6）。 对肺脏及气管组织进行细菌分离，再次分离出溶血性曼氏杆菌。

图6 接种DMQ-Y-Mh 菌株后羔羊肺脏及气管眼观病变

3 讨论

该研究从由呼吸道症状引发的山羊死亡病例临床样本中分离出1 株细菌， 命名为DMQ-YMh。 该菌株在TSA 固体培养基上生长良好，菌落形态、 大小以及染色镜检结果均与溶血性曼氏杆菌相符。 DMQ-Y-Mh 菌株生化鉴定结果中，分解甘露糖一项为阴性，与王晨骁等［10］报道的奶山羊源溶血性曼氏杆菌分离株的甘露糖分解特性一致，但与林裕胜等［11］、郜敏等［12］、马弘财等［13］、江金欢等［14］报道的山羊、绵羊、牦牛源溶血性曼氏杆菌分离株的甘露糖分解特性不一致。 原因可能是DMQ-Y-Mh 菌株缺少分解甘露糖所需的酶。

目前，对溶血性曼氏杆菌耐药性的研究表明，一些分离菌株已经对β-内酰胺类、磺胺类以及氨基糖苷类抗菌药物产生了耐药性。已有研究报道，牛源和绵羊源溶血性曼氏杆菌对卡那霉素、 苯唑青霉素、链霉素、庆大霉素、头孢呋肟、头孢噻吩、罗红霉素等多种抗菌药物表现出耐药性［15-18］。 该研究分离的DMQ-Y-Mh 菌株对环丙沙星、阿奇霉素、庆大霉素敏感，对替米考星、恩诺沙星、泰乐菌素表现出耐药性。 DMQ-Y-Mh 菌株的耐药表型与前人报道的分离自不同地区的溶血性曼氏杆菌的耐药表型存在一定差异。研究表明，菌株来源的地区和畜种差异， 以及不同养殖场抗菌药物的用药习惯，可能导致菌株个体之间耐药表型的不同。因此，需要根据病原菌的药敏试验结果，采取科学、有效的用药方案， 避免因盲目使用抗菌药物带来的细菌耐药性问题。

4 结论

溶血性曼氏杆菌是造成该养殖场发生羊只死亡的病原菌， 药敏试验结果为指导临床用药提供了参考。