蒙古马母体与胎儿胃肠道NF-κB 信号通路相关基因mRNA 相对表达水平研究

蔺雅楠，赵 媛，苏少锋，，赵俊利，李雅静，陶金山，张建强，翁雅娟，武 慧，王秀美，赵一萍

（1.内蒙古农业大学动物科学学院/内蒙古自治区马属动物遗传育种与繁殖重点实验室/农业农村部马属动物遗传育种与繁殖科学观测实验站/内蒙古农业大学马属动物研究中心，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；3.呼和浩特市行政审批和政务服务局综合保障中心，内蒙古 呼和浩特 010020）

肠道作为机体最大和最重要的免疫器官，对维持动物生长发育和机体健康具有重要意义［1］。机体中大多数免疫细胞来自肠道， 约70%的IgA在肠道产生， 超过90%的感染性疾病的产生与肠道有关［2］。 肠上皮细胞在肠道免疫系统中扮演重要角色， 通过产生抗菌化合物和细胞因子等对机体产生免疫作用，保护机体健康［2］。 肠上皮细胞与肠道相关的淋巴组织中的免疫细胞直接接触。 肠道免疫系统主要由肠道菌群、肠上皮细胞、肠上皮内淋巴细胞、 固有层淋巴细胞及派氏淋巴结等构成，通过细胞因子、抗菌肽、代谢产物和众多调节分子的复杂网络紧密相连［3］。 肠上皮细胞表达特异性受体，例如Nod 样受体和Toll 样受体等，这些受体被激活后可诱导细胞信号转导， 进一步激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途径［4］。NFκB 在大部分细胞中均有表达， 尤其是在小肠部位。当机体受到外界刺激时，NF-κB 可以通过调节细胞因子基因的表达，参与机体免疫应答，此外，NF-κB 在炎症反应和抗病原体过程中也发挥重要作用［5］。 NF-κB 家族包括p65 （RelA）、NF-κB1（p50/p105）、NF-κB2 （p52/p100）、RelB 和c-Rel，这些蛋白之间可以相互作用， 并且结合形成同源或异源二聚体，激活或抑制多种基因的表达［6］，来自抗原受体、 模式识别受体、TNF 和IL-1 细胞因子家族成员的受体以及其他多种信号可诱导NFκB 异二聚体的差异激活［7-9］。 NF-κB 信号通路激活因子主要包括TNF-α、IL-1β、IL-8 等［10-12］。

研究表明， 肠道免疫功能在动物胎儿时期就已经开始建立并且逐渐形成［13-14］。 在母马妊娠期间，胎儿的免疫系统就已经产生IgM［15］和IgG［16］。成年马的免疫成分似乎都存在于马驹身上［17］，成年马有60%以上基因的表达水平高于新生马驹［18］。马胎儿的免疫系统从开始建立到趋于完善是一个复杂的过程， 更好地了解其形成过程对于解析马多种疾病的发病机制是必要的。目前，关于母马和新生马驹的免疫研究较多［15-17］，几乎没有关于妊娠母马与胎儿免疫的研究， 围绕马胎儿时期肠道免疫功能的研究更少。 蒙古马作为我国优良的地方马品种，具有耐粗饲、抗性强等特点［19］。 鉴于肠道在机体免疫功能中的重要作用， 该研究采用实时荧光定量PCR 方法（qPCR）检测蒙古马母体及胎儿胃肠道不同区段组织中NF-κB 信号通路6个相关基因的mRNA 相对表达水平， 分析这些基因在母体及胎儿胃肠道组织中的表达谱， 比较其在母体及胎儿胃肠道组织中表达水平的差异，以期为丰富蒙古马母体及胎儿免疫系统的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

从内蒙古包头市达尔罕茂明安联合旗某养殖场随机选取3 匹怀孕的健康蒙古马， 母马平均年龄（8.17±2.75）岁，胎儿平均日龄（165±30）d。

1.1.2 主要试剂

Trizol 试剂，购自宝生物工程（大连）有限公司；硼酸，北京市新光化学试剂厂产品；琼脂糖，Life Technologies Corporation 公 司 分 装； 核 酸 染料，Bioteke Gorporation 公司分装；DNA Marker DL 2 000、PrimeScriptTMRT Master Mix （Perfect Real Time） 试剂盒、TB Green®Premix ExTaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）试剂盒等分子生物学试剂，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3 主要仪器

实时荧光定量PCR 仪（型号：CFX96 Touch）、凝胶成像系统（型号：Gel Doc XR+），美国Bio-Rad公司产品；琼脂糖凝胶电泳仪（型号：DYY-11），北京六一仪器厂产品； 酶标仪 （型号：NanoDrop 2000C），美国Thermo 公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集

将3 匹怀孕蒙古马屠宰， 屠宰过程中取出胎儿，分别采集母体及胎儿的胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠（大结肠、小结肠）和直肠组织，于超低温冰箱（-80 ℃）中保存。

1.2.2 总RNA 提取及质量检测

采用Trizol 法提取蒙古马母体及胎儿胃肠道不同区段组织的总RNA。 称取0.1 g 组织样品研磨成粉末状态，加入1 mL Trizol 裂解，涡旋混匀，室温静置10 min，加入0.2 mL 氯仿混匀，室温静置15 min，4 ℃12 000 r/min 离心15 min， 留上清液加入0.5 mL 异丙醇混匀，室温静置10 min，4 ℃12 000 r/min 离心10 min， 弃上清液， 加入1 mL 75%乙醇， 涡旋振荡，4 ℃7 500 r/min 离心5 min，干燥10 min，使用无RNA 酶水100 滋L 反复吹打几次。 检测提取的样本总RNA 质量和浓度，样品的OD260nm/OD280nm值在1.8～2.0 时可用于后续试验。

1.2.3 cDNA 的合成

按照PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time） 试剂盒说明书进行cDNA 的合成， 合成方法、反应体系和条件参照参考文献［20］中报道的方法。 总反应体系为10 滋L， 制备后立即进行反应，反转录条件为：37 ℃15 min，85 ℃5 s，温度降至4 ℃终止反应，cDNA 合成后于-80 ℃保存。

1.2.4 qPCR 引物设计

以β-actin 基因作为内参基因， 选取NF-κB信号通路上的6 个相关基因NF-κB p50、NF-κB p65、NFKBIA、IL-1β、TNF-琢 和IL-8 作为目的基因。 根据NCBI 的GenBank 数据库中收录的基因序列，使用Primer Premier 3.0 软件进行引物设计，利用NCBI 的Primer-BLAST 功能验证设计引物的特异性。引物序列、参考序列及目的片段长度如表1 所示。该研究所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 qPCR 引物信息

1.2.5 qPCR 检测基因mRNA 相对表达量

使用实时荧光定量PCR 仪对不同组织各基因的mRNA 相对表达量进行分析。 按照TB Green®Premix ExTaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）试 剂盒说明书操作， 反应体系总计20 滋L：TB Green Premix ExTaqⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×conc.）10 滋L，正向引物（10 滋mol/L）0.8 滋L，反向引物（10 滋mol/L）0.8 滋L，cDNA 模板1.0 滋L，DNase/RNase-Free 去离子水7.4 滋L。qPCR 反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变 性60 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40 个循环。最终在4 ℃下保存备用，每个样品的各基因均进行3 次扩增， 分别得出各样品各基因的Ct 值。

1.2.6 数据处理

以β-actin 基因为内参基因，采用2-△Ct（△Ct=目的基因的Ct 值-内参基因Ct 值） 定量分析方法，对NF-κB 信号通路上目的基因的mRNA 相对表达量进行定量分析。采用SPSS 9.0 统计学软件，应用单因素方差分析法对单个基因的mRNA 相对表达量在不同组织间的差异进行显著性检验，利用LSD 法进行多重比较； 采用t 检验法分析母体和胎儿相同组织中单个基因的mRNA 相对表达量差异。P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著，P≥0.05 表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 蒙古马母体胃肠道NF-κB 信号通路相关基因mRNA 相对表达量

检测的6 个基因 （NF-κB p50、NF-κB p65、NFKBIA、IL-1β、TNF-琢 和IL-8） 在蒙古马母体胃肠道不同区段（胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、大结肠、小结肠和直肠）组织中均有表达（见图1A）。8 个组织中NF-κB p65、NF-κB p50 和NFKBIA 基因的mRNA 相对表达量均较高， 而其他3 个基因的mRNA 相对表达量普遍较低。 各基因的mRNA相对表达量在不同组织之间存在差异， 但均未达到显著（P≥0.05）水平（见图1B）。NF-κB p50 基因在胃中表达量最高， 其次是盲肠和直肠；NF-κB p65 基因在胃中表达量最高， 其次是盲肠；NFKBIA 基因在胃中表达量最高，其次是盲肠和回肠；IL-1β 基因在直肠中表达量最高；TNF-琢基因在胃中表达量最高，其次是盲肠；IL-8 基因在盲肠中表达量最高。

图1 NF-κB 信号通路相关基因在蒙古马母体胃肠道不同区段组织中的mRNA 相对表达量

2.2 蒙古马胎儿胃肠道NF-κB 信号通路相关基因mRNA 相对表达量

NF-κB 信号通路的6 个基因 （NF-κB p50、NF-κB p65、NFKBIA、IL-1β、TNF-琢 和IL-8）在蒙古马胎儿胃肠道的8 个组织（胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、大结肠、小结肠和直肠）样品中均有表达（见图2A）。 总体来看，在8 个组织中，NF-κB p50、NF-κB p65 和NFKBIA 基因的mRNA 相对表达量均较高， 而IL-1β、TNF-琢 和IL-8 基因的mRNA 相对表达量均较低。 各基因的mRNA 相对表达量在不同组织之间存在差异， 但均未达到显著（P≥0.05）水平（见图2B）。NF-κB p50 基因在直肠中表达量最高， 在回肠中表达量最低；NF-κB p65 基因在胃中表达量最高， 在大结肠中表达量最低；NFKBIA 基因在小结肠中表达量最高，在空肠中表达量最低；IL-1β 基因在直肠中表达量最高，在小结肠中表达量最低；TNF-琢基因在空肠中表达量最高，在盲肠中表达量最低；IL-8 基因在空肠中表达量最高，在小结肠中表达量最低。

图2 NF-κB 信号通路相关基因在蒙古马胎儿胃肠道不同区段组织中的mRNA 相对表达量

2.3 母体与胎儿胃肠道NF-κB 信号通路相关基因mRNA 相对表达量差异分析

由图3 可知， 检测的6 个基因在不同胃肠道组织的mRNA 相对表达量大部分是母体高于胎儿。 除直肠外，NF-κB p50 基因在母体胃肠道不同区段组织中的mRNA 相对表达量均高于胎儿，在回肠和盲肠中的表达量差异达到显著（P<0.05）水平。 除空肠和回肠外，NF-κB p65 基因在母体胃肠道不同区段组织中的mRNA 相对表达量均高于胎儿，在大结肠中的表达量差异达到显著（P<0.05）水平。 NFKBIA 基因在母体胃肠道不同区段组织中的mRNA 相对表达量均高于胎儿， 在大结肠中的表达量差异达到显著（P<0.05）水平。 除空肠外，IL-1β 基因在母体胃肠道不同区段组织中的mRNA 相对表达量均高于胎儿，但表达量差异均未达到显著（P≥0.05）水平。 除空肠和直肠外，TNF-琢基因在母体胃肠道不同区段组织中的mRNA 相对表达量均高于胎儿， 但表达量差异均未达到显著（P≥0.05）水平。IL-8 基因在母体胃肠道不同区段组织中的mRNA 相对表达量均高于胎儿， 在大结肠中的表达量差异达到显著（P<0.05）水平。

图3 蒙古马母体与胎儿胃肠道不同区段组织中NF-κB 信号通路相关基因mRNA 相对表达量

3 讨论

NF-κB 家族转录因子在调节细胞分化、增殖、存活、凋亡、免疫应答和炎症反应等多种生物学过程中起着重要作用［21］。 典型的NF-κB 被激活后可调节靶基因的转录，以应对各种外部刺激，导致相应生理病理变化［22］。 NF-κB p50 异源二聚体主要受IκBα 蛋白调控， 该蛋白的基因表达形式是NFKBIA 基因［9］。 赵一萍等［23］采用qPCR 技术分析了蒙古马肝脏、脾脏、肺和血液中的NF-κB 信号通路上7 个基因的表达情况， 发现NF-κB p50、NF-κB p65 和NFKBIA 基因在4 个部位有较高表达， 而IL-1β、TNF-α 和IL-8 基因的mRNA 相对表达量均较低。 该研究对蒙古马母体及胎儿胃肠道组织中NF-κB 信号通路的6 个基因mRNA 相对表达量的测定结果与赵一萍等的研究结果基本一致，即NF-κB p50、NF-κB p65 和NFKBIA 基因在胃肠道8 个部位有较高表达， 而IL-1β、TNF-α和IL-8 基因的mRNA 相对表达量均较低，这可以说明NF-κB p50、NF-κB p65 和NFKBIA 基因在蒙古马免疫调控中发挥重要作用。Collado-Romero等［24］和Li 等［25］使用qPCR 技术对猪不同部位免疫系统中相关基因的mRNA 相对表达水平进行定量分析，分别发现NF-κB p50 基因的表达量为回肠＞空肠＞结肠和NF-κB p65 基因的表达主要集中在小肠部位。 该研究对蒙古马母体肠道组织中NFκB p50 和NF-κB p65 基因mRNA 相对表达量的测定结果与Collado-Romero 等和Li 等的研究结果基本一致， 即NF-κB p50 基因在回肠中的表达量最高，其次为空肠和结肠，而NF-κB p65 基因基因在母体和胎儿的小肠部位有较高的表达量，说明NF-κB p50 和NF-κB p65 基因在蒙古马肠道免疫调节中占据不可忽视的地位。 NF-κB 被激活后会诱导产生大量的促炎细胞因子，例如IL-1β、TNF-α、IL-8 等，进而诱导炎症发生［26］。Lindenberg等［27］通 过qPCR 测 量 编 码IL-6，IL-10 和TNF-α等基因在24 匹健康马的回肠、盲肠和结肠均有表达。 该研究对蒙古马母体及胎儿胃肠道组织中NF-κB 信号通路的TNF-α 基因mRNA 相对表达量定量分析， 发现其在回肠、 盲肠和结肠均有表达，与Lindenberg 等研究结果基本一致，但表达量很低，这与选取的试验动物体况健康，没有发生肠道感染性疾病有关。研究表明IL-1β［28］、TNF-α［24］、IL-8［24］基因在不同组织中的表达量存在差异。 该研究检测到IL-1β、IL-8 和TNF-α 基因在蒙古马母体及胎儿胃肠道不同区段组织中的mRNA 相对表达量均较低，这可能与选取的马匹体况健康、没有发生炎症有关，也可能说明肠道作为免疫器官，在蒙古马母体和胎儿的生长发育中扮演重要角色，胎儿和母体的肠道免疫可能存在潜在联系。该研究检测的6 个基因在不同胃肠道区段组织中的mRNA 相对表达量基本表现为母体高于胎儿，这可能是由于母体的胃肠道发育比较完善， 而胎儿的肠道免疫正在建立， 并且母体肠道可能受到外源刺激，进而触发机体肠道免疫系统，产生连锁反应， 导致母体的基因表达量高于胎儿。 在该研究中， 对比母体和胎儿不同部位相关基因mRNA 相对表达量的差异发现，NF-κB p50 基因在母体和胎儿的盲肠及回肠中的表达量差异显著 （P<0.05），NF-κB p65 基因和NFKBIA 基因在大结肠中的表达量差异显著（P<0.05），并且3 个基因的表达量均为母体高于胎儿，充分说明NF-κB p50、NF-κB p65 和NFKBIA 基因在肠道免疫调节中的重要性。

4 结论

NF-κB 信号通路上6 个基因在蒙古马母体和胎儿胃肠道8 个组织中均有表达， 且存在一定差异； 母体部分肠道区段组织中的NF-κB p50、NFκB p65、NFKBIA 基因mRNA 相对表达量显著高于胎儿。