代森锰及其代谢物的神经毒性影响与机制研究

刘朝阳,刘泽华,方艳艳,杨伯元

代森锰及其代谢物的神经毒性影响与机制研究

刘朝阳1,2,3*,刘泽华1,2,方艳艳1,2,杨伯元1,2

(1.中南财经政法大学环境与健康研究中心,湖北 武汉 430073；2.中南财经政法大学环境科学与工程系,湖北 武汉 430073；3.武汉大学人民医院,湖北 武汉 430060)

以SH-SY5Y和PC12细胞为实验模型,深入探讨了代森锰(Maneb)及其代谢产物对多巴胺能神经细胞的毒性影响与机制.结果表明,Maneb的有机部分和金属离子成分单独暴露不具有明显的毒性作用,联合暴露具有协同效应,且对细胞活性的抑制程度与同一浓度水平的Maneb相当,其原因与诱导活性氧自由基生成、细胞凋亡相关.此外,蛋白免疫印迹法发现,Maneb下调Bcl-2的表达、上调Bax、细胞色素C的水平,同时激活Caspase-3,提示线粒体凋亡途径在Maneb诱导多巴胺能神经细胞凋亡过程中的重要作用.

代森锰；SH-SY5Y细胞；PC12细胞；氧化应激；细胞凋亡

代森锰(Maneb)是一种典型的二硫代氨基甲酸酯类(DTC)杀菌剂,在农业生产中应用范围广泛[1],主要用于蔬菜、果树的种植,可防治各种炭疽病、霜霉病、黑星病、疫病和斑点等[2].随着该产品生产量和使用量的增加以及使用范围的扩大,Maneb及其降解产物在地表水、饮用水、农作物和食品中都可被检出[3-6],其对人类健康和环境安全的影响日益受到人们的关注.

目前关于Maneb毒性效应的研究表明其具有潜在的发育毒性和神经毒性.根据流行病学研究,在职业场景中单独暴露于Maneb或者联合暴露于Maneb和其它农药均能显著增加帕金森病(PD)的患病风险[7-8].体内研究表明,Maneb暴露可降低斑马鱼的生存能力和孵化率,并诱导脊索畸形导致发育毒性,而高浓度的Maneb暴露可产生神经毒性,使斑马鱼产生运动功能障碍[3,9].此外,Maneb可特异性地诱导多巴胺能神经元毒性损伤[10-11],且能诱导小鼠产生PD样行为学和病理学改变[12],表现为运动功能障碍、大脑纹状体多巴胺水平下降等[13].而根据体外研究结果显示,Maneb的神经毒性机制研究集中在α-突触核蛋白的聚集、蛋白质硫醇烷基化、线粒体功能障碍、谷胱甘肽氧化导致的氧化应激、细胞凋亡等途径[14-19].Maneb由Mn2+和有机配体乙二硫代氨基甲酸酯(EBDC)共同构成,Maneb的溶液形式相对稳定,但也可能降解为Mn2+和游离的EBDC[3].以往的研究发现使用Maneb处理细胞后会导致细胞培养液中Mn2+的积累[20-22].此外,许多研究表明乙撑硫脲(ETU)是Maneb有机部分的主要降解和代谢产物[23-25].目前,Maneb的有机部分和金属离子成分都已被证明具有潜在的毒性[20-21].然而Maneb针对多巴胺能神经细胞的主要毒性成分研究存在缺失,其致神经细胞的毒性效应和机制尚待阐明.

本研究选取Maneb及其代谢产物为研究目标,以多巴胺能神经细胞SH-SY5Y细胞和PC12细胞为模型,从细胞活力、细胞内活性氧自由基(ROS)生成、细胞凋亡水平来评价各毒素成分的单独和联合毒性效应,从而探讨Maneb的主要毒性成分.此外,通过检测不同浓度梯度Maneb处理下,细胞中线粒体凋亡途径关键蛋白如Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达水平,以深入研究线粒体凋亡途径在Maneb暴露致多巴胺能神经细胞凋亡中的作用,从而为进一步研究Maneb诱导神经细胞损伤机制提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 化学试剂 Maneb、代森钠(Nabam)、ETU均购自阿尔塔科技有限公司(1ST21098, 1ST21096, 1ST21100, 1ST24013),MnCl2购于上海麦克林生化科技有限公司(M813486).Cell Counting KIT-8 (CCK-8)试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司(CK04);活性氧测定试剂盒购于南京建成科技有限公司(E004-1-1);细胞凋亡与坏死检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司(C1056);Bax抗体、Cytochrome C抗体购于Abcam公司(ab32503, ab133504), Bcl-2抗体购于Cell Signaling Technology公司(10571T),甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体、Caspase-3抗体购于Proteintech公司(HRP- 60004, 19677-1-AP).

1.1.2 仪器设备 二氧化碳培养箱(HERAcell150i, Thermo Scientific);生物安全柜(HR40-IIA2, Haier);化学发光成像系统(ChemiDocTMTouch, Bio-Rad Laboratories);倒置荧光显微镜(IX73, OLYMPUS);酶标仪(SpectraMaxi3x, Molecular Devices).

1.1.3 细胞培养 人神经母瘤细胞SH-SY5Y和大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12由武汉大学生命科学院提供,使用DMEM培养基(含10%胎牛血清,1%青霉素-链霉素溶液),置于37℃、5% CO2恒温培养箱中传代培养,取对数生长期的细胞进行实验.

1.2 实验方法

1.2.1 Maneb及其代谢产物对细胞的暴露 使用二甲基亚砜(DMSO)溶解Maneb及其代谢产物,配置浓度为100mmol/L的储存液于-80℃中保存, 10mmol/L的使用液于-20℃中保存,临用前使用DMEM培养基稀释至实验处理浓度,并保证DMSO体积分数小于0.1%.处理细胞时,先将对数生长期细胞接种于培养皿或培养板中,在培养箱中培养24h后弃原培养基,加入含有设定浓度药品的新培养基.根据以往的研究[15,21],本文使用Nabam和MnCl2分别模拟Maneb的有机主体和金属离子成分.

1.2.2 细胞活性的检测 使用CCK-8法测定细胞活性.将SH-SY5Y细胞和PC12细胞分别接种于96孔板中,约1×104细胞/孔,在37℃、5% CO2恒温培养箱中培养24h后用于实验.根据预实验的结果,用不同浓度的毒素处理细胞,每个浓度至少设置3个重复.处理24h后,弃培养基,每孔加入100μL的新培养基,再加入10μL的CCK-8溶液,在37℃、5% CO2恒温培养箱中培养1h后,在450nm波段用酶标仪读数.

1.2.3 细胞内ROS的检测 使用DCFH- DA探针法检测细胞内ROS的水平.将SH-SY5Y细胞和PC12细胞分别接种于12孔板中,约1×105细胞/孔,在37℃、5% CO2恒温培养箱中培养24h后用于实验.针对不同的毒素,使用相同的浓度(20μmol/L)处理细胞,每个浓度设置6个重复.在处理24h后,弃原培养基,加入500μL无血清DMEM培养基配置的浓度为10mmol/L的DCFH-DA染色液.在37℃、5% CO2恒温培养箱中孵育20～30min,使用PBS洗涤3次后,直接在荧光显微镜中观察并拍照.

1.2.4 细胞凋亡的检测 使用Hoechst 33342/PI双染法检测细胞凋亡与坏死情况.将SH-SY5Y细胞和PC12细胞分别接种于12孔板中,约1×105细胞/孔,在37℃、5% CO2恒温培养箱中培养24h后用于实验.处理方式和浓度与1.2.3相同,染色液使用试剂盒中的缓冲液配置,每800μL的染色缓冲液中,Hoechst染色液和PI染色液各加入5μL.在4℃条件下孵育20～30min,使用PBS洗涤一次后,在荧光显微镜下观察并拍照.记录细胞的Hoechst蓝色荧光和PI红色荧光图,并将两种荧光图重叠得到Merge处理的图片.

1.2.5 蛋白免疫印迹法检测蛋白表达水平 在细胞培养皿中分别培养并用Maneb处理SH-SY5Y和PC12细胞24h,使用含蛋白酶抑制剂的NP-40裂解液(NP- 40Lysis Buffer)提取并溶解细胞内蛋白,加入蛋白上样缓冲液混合后,在100℃条件下煮沸10min制得蛋白样.电泳时,每孔上样量为10μg,60V恒压电泳60min后调至120V恒压电泳30min,使用蛋白转印系统将蛋白转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,5%脱脂牛奶常温封闭1h,孵育一抗,4℃过夜.次日,用洗膜缓冲液(TBST)洗6次,室温孵育二抗1h,再次用TBST洗膜6次后,在化学发光成像系统中显影.

1.2.6 统计学分析 荧光值和蛋白条带灰度值均使用ImageJ软件读取分析.实验数据均由SPSS statistics 22.0完成统计学分析,并使用Graphpad Prism 8.0制作图表,结果均以平均值±标准差(±SD)表示,再使用单因素方差分析法比较各组之间的差异,以<0.05为显著性标准.

2 结果与分析

2.1 Maneb及其代谢产物暴露下细胞形态变化观察

A为SH-SY5Y细胞处理组;B为PC12细胞处理组;标尺=25μm

使用Maneb、Nabam、ETU、MnCl2分别处理SH-SY5Y和PC12细胞,白光下观察对细胞密度和形态的影响如图1所示.处理浓度在20μmol/L以上时,Maneb对SH-SY5Y细胞和PC12细胞都有明显的损伤,主要表现在处理24h后细胞密度减小、贴壁率降低、细胞间隙增大且出现皱缩现象.作为Maneb的主要代谢产物,ETU和MnCl2在处理浓度大于600μmol/L时会出现类似现象;对于与Maneb有机部分相同的Nabam,其处理浓度在200μmol/L以上时能对细胞产生明显的毒性作用.而将Nabam与MnCl2联合暴露于细胞时,在30μmol/L的处理浓度下便能损伤大量细胞,其毒性作用与Maneb相当.

2.2 Maneb及其代谢产物对神经细胞的毒性

使用Maneb和Nabam分别处理SH-SY5Y和PC12细胞,通过CCK-8法检测它们对细胞活性的影响,结果如图2所示.Maneb浓度依赖性地影响细胞活力,随着处理浓度的增加,细胞活力逐渐减少.在浓度为20μmol/L时,使用Maneb处理24h使细胞活力下降过半;Nabam在低浓度时对细胞活力没有影响,处理浓度为400μmol/L时会使细胞活力大幅降低.

ETU、MnCl2以及Nabam与MnCl2联合作用对SH-SY5Y和PC12细胞活力影响如图2所示.处理时间为24h,处理浓度低于200μmol/L时,ETU和MnCl2的单一暴露对细胞活力的影响较小,其中MnCl2对细胞的刺激作用稍大于ETU.处理浓度低于200μmol/L时,Nabam对细胞活力影响较小.而使用Nabam联合MnCl2处理细胞时,二者毒性表现为协同作用,在20μmol/L的浓度条件下使细胞活力大幅下降,对细胞活力的影响远大于单一暴露.这与2.1中细胞形态观察结果一致.

图2 Maneb及其代谢产物对多巴胺能神经细胞活力的影响

A、B为SH-SY5Y细胞处理组;C、D为PC12细胞处理组

2.3 Maneb及其代谢产物对神经细胞ROS水平的影响

在20μmol/L的浓度条件下,分别使用Maneb、Nabam、ETU、MnCl2以及Nabam+MnCl2处理SH-SY5Y细胞和PC12细胞24h.如图3所示,单一暴露处理中,Maneb处理组诱导细胞产生的ROS与对照组及其他单一药物处理组相比差异极显著(<0.01).ETU和MnCl2处理组与对照组相比基本没有差异,Nabam处理组能诱导细胞产生极少的ROS,与对照组相比有显著差异(<0.05).联合暴露中,Nabam与MnCl2的同时处理可诱导细胞产生大量ROS,与Nabam和MnCl2单一处理组相比差异极显著(<0.01),与Maneb单一处理诱导的ROS生成量相当,呈现协同作用.

图3 Maneb及其代谢产物对多巴胺能神经细胞ROS水平的影响

A、B分别为SH-SY5Y和PC12细胞ROS荧光图;C为柱形统计图

字母表示多巴胺能神经细胞暴露于20μmol/L浓度的各毒素产生ROS的差异性,字母相同代表差异性不显著(>0.05),字母不同代表差异性显著(<0.05);荧光图标尺=50μm

A、B分别为SH-SY5Y和PC12细胞凋亡荧光图;C为柱形统计图

字母表示多巴胺能神经细胞暴露于20μmol/L浓度的各毒素发生凋亡的差异性,字母相同代表差异性不显著(>0.05),字母不同代表差异性显著(<0.05);荧光图标尺=50μm

2.4 Maneb及其代谢产物对神经细胞凋亡的影响

与2.3的处理方式类似,在20μmol/L的浓度条件下,分别使用Maneb、Nabam、ETU、MnCl2以及Nabam+MnCl2处理SH-SY5Y和PC12细胞24h,Maneb及其代谢产物对细胞凋亡水平的影响如图4所示.对于单一暴露,在Maneb处理组中,细胞凋亡率与对照组和其他处理组相比具有显著差异,说明Maneb可诱导细胞凋亡且毒性显著高于其代谢产物.对于Nabam和MnCl2的联合暴露,其诱导的细胞凋亡水平显著高于Nabam和MnCl2单一暴露的结果,表明它们对细胞凋亡的诱导也具有协同作用.

2.5 Maneb对神经细胞内线粒体凋亡途径相关蛋白表达水平的影响

图5 Maneb对神经细胞内线粒体凋亡途径相关蛋白表达的影响

A、C分别为SH-SY5Y和PC12细胞的WB条带图;B、D分别为A、C对应的柱形统计图

与对照组相比,*<0.05,**<0.01,***<0.001,****<0.0001

在不同浓度的Maneb中暴露24h后,SH-SY5Y细胞和PC12细胞内线粒体凋亡途径中的关键生物标志物Bax、Bcl-2、Caspase-3和Cytochrome C (Cyt C)的蛋白表达水平的变化见图5.与对照组相比,Bax、Cyt C、Caspase-3蛋白表达水平均呈上升趋势,Bcl-2呈下降趋势,其变化程度与Maneb的暴露剂量呈正相关.Maneb的处理浓度达10μmol/L以上时,Bax、Cyt C、Caspase-3蛋白表达水平呈显著上升,Bcl-2表达水平呈显著下降.这些结果表明, Cyt C和Caspase-3可能在Maneb引起的细胞凋亡中起重要作用,而Bax和Bcl-2蛋白水平的改变也预示着线粒体凋亡途径被激活.

3 讨论

3.1 Maneb对神经细胞毒性的主要毒性成分

以往对于Maneb毒性作用的讨论主要分为三类:一是金属离子成分,尤其是Mn2+导致了细胞毒性.多项研究证实,在体内和体外模型中,使用Maneb处理后会导致体内和体外模型中Mn2+浓度显著增加[20,26-27].因此,Maneb有可能通过改变细胞内的金属浓度来破坏金属稳态.Vaccari等[28]的研究表明,是Maneb的金属离子成分Mn2+而非有机部分,抑制了脑突触囊泡中的谷氨酸转运蛋白.二是Maneb的有机部分而非金属离子导致了神经细胞毒性.Soleo等[29]发现代森锰锌(Mancozeb)和代森锌(Zineb, ZB)对于原代中脑细胞的毒性作用相当,从而支持了这一观点.三是Maneb的毒性可能是涉及有机部分和金属离子成分的共同作用机制,这主要是通过研究Nabam和MnCl2联合暴露的毒性来证实的[24,30].

本研究发现MnCl2在较高浓度下会抑制细胞增殖和细胞活性,但在与Maneb相同的处理条件下,MnCl2并未产生毒性效应,这与以往的研究结果相同.Carmona等[22]比较了不同存在形式的锰对多巴胺能神经细胞的毒性,结果发现Maneb的毒性最大且显著大于MnCl2和硫酸锰(MnSO4).Hoffman等[21]指出MnCl2会导致细胞中的Mn显著积累,但在Maneb的毒性浓度下并不会对细胞产生毒性.另一项研究以结肠细胞为模型,发现Maneb毒性显著大于与其有机部分相同的Zineb,而MnCl2的毒性与ZnCl2相当[20],说明决定Maneb毒性作用大小的并非金属离子成分.

表1 EBDC类物质及其降解产物的化学结构

在毒性效应层面上,本研究发现处理浓度为20μmol/L时,在SH-SY5Y和PC12细胞中,Maneb可显著诱导ROS的生成,并导致细胞凋亡,但相同处理条件下MnCl2暴露并没有产生毒性效应.Domico等[31]使用MnCl2处理大鼠中脑多巴胺能细胞和γ-氨基丁酸(GABA)能细胞时,在相同浓度条件下,其产生的ROS远低于Maneb.这些结果表明Mn2+并不能完全解释Maneb的细胞毒性,Maneb的有机部分在细胞毒性过程中也发挥着重要作用.另外,由于Nabam有着与Maneb相同的核心有机成分,多项研究使用Nabam研究Maneb有机部分的毒性作用[20-21,24,31],结果与本研究一致,即Nabam仅在较高的浓度下才会产生细胞毒性.又因为Maneb的有机部分会降解和代谢为ETU,本研究发现ETU对多巴胺能神经细胞活性影响较小,在Maneb的毒性浓度下对细胞活性氧水平和细胞凋亡率并无影响,这与以往的研究结果类似[24,31].Maneb和ETU的化学结构见表1.综上,仅有机部分也不能完全解释Maneb的细胞毒性作用.

本研究提出Maneb的有机部分和金属离子成分的协同毒性效应,将细胞同时暴露于Nabam和MnCl2,以模拟Maneb的化学结构.结果显示,Nabam与MnCl2联合暴露的毒性显著高于此二种毒素单独处理细胞时的毒性,对SH-SY5Y和PC12细胞活性的损伤效果与Maneb相近,在相同处理浓度下其导致细胞产生ROS的水平和诱导细胞凋亡的水平与Maneb相当.Hoffman等[21]使用Nabam和MnCl2联合处理结肠细胞时,在与Maneb相同的浓度范围内,导致了细胞存活率的降低,同时细胞产生的过氧化物水平与Maneb相近.这些数据都支持了Maneb的有机部分和金属离子部分之间的协同毒性机制.此外,在有机部分发挥毒性作用的机理研究中, EBDC类杀菌剂的有机配体具有与Cu2+、Zn2+螯合的能力,促进其在细胞内的积累,故有机部分导致的细胞内金属浓度的上升很可能在Maneb细胞毒性中发挥作用.金属在各种生化反应中充当着催化辅助因子,因此,它们的浓度受到生物系统的严格调节,而这种稳态控制会被细胞内金属离子的积累所破坏.在Maneb暴露于细胞时,还会导致Mn2+在细胞内的积累,而这些金属离子的积累会进一步导致ROS的产生.

总之,Maneb的有机部分可以与一些过渡金属离子螯合,促进其在细胞内的积累,但毒性作用有限.Hoffman的结论表明[20-21],暴露于Maneb时,其有机部分会导致HT-29细胞和Caco2细胞中Mn、Zn和Cu的显著积累,细胞内金属浓度的快速增加改变了金属稳态,产生金属超载状态,导致氧化损伤,进而产生细胞毒性.Maneb的毒性可能是其有机部分和金属离子成分协同作用产生的.

3.2 Maneb暴露致神经细胞凋亡的作用及机制

针对Maneb暴露对多巴胺能神经细胞的毒性作用,本研究使用CCK-8法揭示了其对SH-SY5Y和PC12细胞增殖活性的抑制,在此基础上,进一步对Maneb抗增殖作用的深层次机理进行探讨,即从ROS生成、细胞凋亡通路的分子层面阐述其致神经细胞的损伤机制.

ROS是氧化应激的指示物,可作为信号转导分子直接或间接调节基因的表达从而导致细胞毒性[32],其稳态浓度的增加会干扰细胞代谢、诱导细胞凋亡或坏死[33],而线粒体是细胞内ROS的主要来源[34].有研究提出,Maneb会诱导还原性谷胱甘肽(GSH)的上调,但在与百草枯共同作用时并不能增加SH-SY5Y细胞中ROS的积累[19],低浓度Maneb的暴露并不会对大鼠神经干细胞ROS的稳态和抗氧化系统产生影响[10].本研究中,毒性浓度的Maneb可显著诱导SH-SY5Y和PC12细胞中的ROS生成,引起细胞凋亡和坏死,进而抑制了细胞增殖.如3.1所述,Maneb可能通过扰乱细胞内的金属稳态导致ROS的增多,而ROS的产生可能会与线粒体的损伤相互促进而加强细胞毒性,并诱导细胞凋亡.

细胞凋亡是程序性细胞死亡过程,在生物体正常发育、细胞内环境稳态的维持过程中均发挥着重要作用,而细胞凋亡失调或过度凋亡会导致多种疾病[35],如多巴胺能神经元的过度凋亡可导致帕金森病的发生[36].本研究中,Maneb在20μmol/L的浓度下可显著导致SH-SY5Y和PC12细胞的凋亡.研究表明,细胞凋亡与线粒体功能异常密切相关,最主要的内源性凋亡途径即是线粒体凋亡途径[37].而在Maneb的毒性机制中,线粒体功能障碍是重要因素.Maneb可特异性损伤线粒体呼吸链复合物III即细胞色素C还原酶,但其具体的作用机制尚不清楚[16].最新的研究中,Anderson等[15,17]发现Maneb可通过其硫醇结构发挥毒性作用,Maneb的聚合物构型与线粒体蛋白的硫醇结构具有空间邻近性,这有助于Maneb靶向针对线粒体关键代谢酶中高度敏感的蛋白质硫醇和Fe-S簇直接相互作用,导致线粒体功能失调.总之,Maneb诱导多巴胺能神经细胞凋亡的作用与其对线粒体功能的损伤密切相关,线粒体凋亡途径可能是其诱导细胞凋亡的主要途径.

3.3 Maneb暴露致神经细胞凋亡中的线粒体凋亡途径

线粒体凋亡途径中,在DNA损失、氧化应激等各种凋亡信号的刺激下,位于线粒体外膜上的Bcl-2家族蛋白表达异常,包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax间的相互作用,导致线粒体膜的通透性改变,从而降低线粒体的膜电位[38].而后处于线粒体膜间隙的细胞色素C被释放至细胞质中,与胞质中的另一凋亡蛋白Apaf-1结合而激活Caspase级联反应,进而诱导细胞凋亡[39].研究发现,Maneb可能激活线粒体通路,诱导细胞凋亡[40-41].本研究结果显示, Maneb可抑制SH-SY5Y和PC12细胞的增殖,并诱导细胞凋亡,且能浓度依赖性上调Bax、Cyt C和Caspase-3的蛋白表达水平,下调Bcl-2蛋白表达水平.以上结果提示了Maneb诱导的SH- SY5Y和PC12细胞凋亡可能是通过线粒体凋亡途径实现的.但关于Maneb激活线粒体凋亡途径中的信号通路变化和具体分子机制有待进一步的研究.

总之,Maneb致SH-SY5Y和PC12细胞的损伤机理涉及氧化应激、细胞凋亡及凋亡信号转导通路,其可能的途径为:Maneb的有机部分和金属离子成分导致了金属离子如Cu2+、Zn2+、Mn2+在细胞内的积累,因此引起了SH-SY5Y和PC12细胞内氧化应激增强,产生了过多的ROS,加之其对线粒体呼吸链复合物III的特异性抑制,导致了线粒体功能障碍,进一步激活了线粒体凋亡通路中各分子Bax、Caspase-3表达升高,Bcl-2表达降低,同时使Cyt C从线粒体中释放至胞浆,诱导细胞凋亡,并最终影响细胞增殖和活性.以上结果提示Bax和Bcl-2参与的线粒体凋亡途径,在Maneb诱导多巴胺能神经细胞凋亡的过程中起重要作用.

4 结论

4.1 Maneb对多巴胺能神经细胞的毒性作用显著强于其代谢产物.较低浓度的Maneb的代谢产物暴露对细胞形态、细胞活性、ROS水平、细胞凋亡的影响并不明显.

4.2 Nabam和MnCl2联合暴露时产生的毒性效应与Maneb单独暴露相当,能显著抑制多巴胺能神经细胞的细胞活性、提高ROS水平、诱导细胞凋亡.

4.3 Maneb会通过线粒体凋亡途径诱导多巴胺能神经细胞凋亡.随着Maneb暴露浓度的增加,细胞中Bcl-2的表达降低,Bax、Cyt C表达升高, Caspase-3水平上升.

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Neurotoxic effects and mechanisms of Maneb and its metabolites.

LIU Chao-yang1,2,3*, LIU Ze-hua1,2, FANG Yan-yan1,2, YANG Bo-yuan1,2

(1.Research Center for Environment and Health, Zhongnan University of Economics and Law, Wuhan 430073, China；2.Department of Environmental Science and Engineering, Zhongnan University of Economics and Law, Wuhan 430073, China；3.Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China)., 2022,42(9)：4399～4408

The toxicological effects and mechanisms of Maneb and its metabolites on dopaminergic cells were investigated in depth using SH-SY5Y cells and PC12 cells as experimental samples. The results showed that the organic and metal ion components of Maneb did not have obvious toxic effects when exposed alone, but had synergistic effects when exposed in combination, and the degree of inhibition to cells viability was comparable to that of Maneb at the same concentration level. The reasons for this were related to the generation of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis. In addition, the Western Blotting revealed that Maneb reduced the expression of Bcl-2, elevated the level of Bax and Cytochrome C and activated Caspase-3 in a dose-dependent manner, suggesting an important role of the mitochondrial apoptosis pathway in dopaminergic cells apoptosis induced by Maneb.

Maneb；SH-SY5Y cells；PC12 cells；oxidative stress；cell apoptosis

X171.5

A

1000-6923(2022)09-4399-10

2022-02-18

国家自然科学基金优秀青年基金项目(81822016),国家自然科学基金面上项目(81571249),中国博士后科学基金项目(2020M672420),高等学校学科创新引智基地(B21038)

*责任作者, 副教授, lcy@zuel.edu.cn

刘朝阳(1986-),男,湖北洪湖人,副教授,博士,主要研究方向为环境毒理与健康、环境健康风险评估.发表论文近40篇.