大口黑鲈抗缪勒氏管激素（AMH）原核表达及多克隆抗体制备

郭 琦， 王向斌， 黄 茜， 梁子怡， 王心雨， 刘慧芬＊

（河南师范大学水产学院， 河南新乡 453007）

抗缪勒氏管激素（Anti-Müllerian hormone，Amh）又称缪勒氏管抑制物， 是转化生长因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β） 超家族中的一员[1]。在哺乳动物中，Amh表达于精巢的支持细胞，可引起缪勒氏管的退化，维持雄性特征[2]。 雌性个体中，Amh在原始卵泡的募集以及优势卵泡选择中发挥重要作用[3]。 虽然绝大多数鱼类没有缪勒氏管，但是却保留了Amh基因。 2002年在日本鳗鲡中发现Amh基因，主要在支持细胞中表达，与精子发生有关[4]。 硬骨鱼类中，虽然Amh主要在雄性性别分化中发挥关键作用，但其在雌性卵巢中也有表达。 在斑马鱼中敲除Amh基因会导致卵巢肥大，初级卵母细胞数量显著增多，卵母细胞发育进程受阻[5]。 使用花鳍骨AMH重组蛋白对卵母细胞进行体外孵育， 结果发现AMH重组蛋白可以促进花鳍骨卵母细胞成熟[6]。这说明Amh在鱼类性腺发育过程中发挥一定作用。

大口黑鲈（Micropterus salmoides），又名加州鲈，隶属于鲈形目 （Perciformes）、 太阳鱼科（Cehtrachidae）、黑鲈属（Micropterus），具有肉质鲜美、抗病力强、 生长迅速、 适温范围较广等优点。 大口黑鲈自1983年被引入内地以来， 在全国多地区实现了人工养殖[7]。目前关于大口黑鲈品种开发、营养品质、养殖模式分析等方面已有较多研究， 但是有关其性腺发育及相关分子调控机制的研究鲜有报道。

本研究利用已经获得的大口黑鲈Amh基因cDNA全长序列，构建原核表达载体，制备多克隆抗体，以期为研究Amh基因的功能及其在大口黑鲈性腺发育中的分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与主要试剂

大口黑鲈购自于新乡市洪门镇鲈鱼养殖基地，暂养于河南师范大学水产养殖基地。 用于多克隆抗体制备的小鼠购自华兰生物工程股份有限公司。

感受态细胞、限制性内切酶、pET-32a（+）载体等购自宝日医生物技术(北京)有限公司。 彩虹180广谱蛋白Marker、 弗氏佐剂等购自北京索莱宝科技有限公司。His Tag HP镍柱购自上海生工生物工程股份有限公司。 实验所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 原核表达载体构建

根据Amh基因序列， 选择合适的区域设计特异性引物， 同时根据原核表达载体pET32a的图谱选取酶切位点，具体信息见表1：

表1 重组载体引物

以大口黑鲈卵巢cDNA为模板，通过PCR扩增序列、 琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。 将回收产物和pET-32a质粒用BamH I 和Xho I限制性内切酶双酶切（37℃，过夜），酶切产物纯化后，构建重组表达载体pET32a-AMH。 将重组质粒转化至BL21感受态细胞中，挑选阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序， 采用DNAMAN软件对测序结果进行比对分析，以判断目的基因是否正确插入载体。

1.3 融合蛋白诱导表达

将阳性表达菌接入LB液体培养基中进行扩大培养（取部分菌液作为对照），37℃震荡培养至OD6000.5左右， 向其中加入IPTG （Isopropyl β-D- Thiogalactopyranoside，终浓度1 mmol/L）进行诱导表达，37℃震荡培养，在培养6 h、8 h、10 h及12 h后取材，12000 rpm离心20 min，收集沉淀。菌体沉淀以4×loading buffer重悬裂解，随后使用SDS-PAGE对总菌体、沉淀和上清进行检测。

1.4 融合蛋白纯化及抗体制备

用上述条件大量诱导蛋白， 在室温下8000 rpm离心5 min收集菌体， 加入适量变性结合缓冲液，超声波破碎 （破3 s， 停3 s， 功率50%， 破碎总时间30 min），获得融合蛋白，用His Tag HP柱纯化蛋白。蛋白纯化所需试剂配制及操作方法参照冯军厂的方法[8]。 用纯化透析后的融合蛋白免疫小鼠，每隔一周加强免疫一次， 首次将融合蛋白与弗氏完全佐剂等比混合后对小鼠进行皮下注射， 之后每次将融合蛋白与弗氏不完全佐剂等比混合后注射，4周后采血获得抗血清。

1.5 抗体效价检测

利用酶联免疫 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法检测制备抗体的效价，测定时以未免疫的小鼠血清作为阴性对照。

1.6 数据分析

采用SPSS 22.0统计分析， 不同组之间的差异显著性（P＜0.05）采用单因素方差分析（ANOVA）进行检验，Duncan氏方法多重比较， 实验数据均使用平均值±标准误（mean ± SE）表示。

2 结果与分析

2.1 重组表达载体构建

以大口黑鲈卵巢cDNA为模板进行扩增，获得的目的片段与预期大小一致 （图1 a）。 重组质粒pET32a-AMH经单双酶切验证， 检测目的片段已成功导入表达载体（图1 b）。 随后，将产物进行纯化、测序，结果表明构建的pET32a-AMH正确。

图1 Amh目的片段扩增及验证

2.2 重组蛋白诱导表达及可溶性检测

构建好的重组质粒pET32a-AMH转入大肠杆菌BL21。 随后采用IPTG在16℃下进行诱导，SDS-PAGE检测发现，在52.3 kDa左右出现目的条带，而对照在同一区域未出现特异条带， 表明重组表达载体pET32a-AMH构建成功。 诱导后菌体经超声破碎、离心、SDSPAGE电泳分析表明重组蛋白主要存在于沉淀中。

2.3 重组蛋白纯化

对诱导菌液进行收集、破碎，利用亲和纯化的方法，对AMH融合蛋白进行纯化。使用不同浓度咪唑洗脱液洗脱蛋白，SDS-PAGE 电泳检测结果显示，100 mM咪唑洗脱时开始检测到目的蛋白；150 mM和200 mM咪唑洗脱时，检测到大量的目的蛋白，但是200 mM 咪唑浓度洗脱时，获得的目的蛋白纯度更高（图2）。经透析去除杂质，SDS-PAGE电泳检测结果显示，纯化后的杂蛋白明显减少，条带较为单一，可用于后续实验（图3）。

图3 AMH重组蛋白不同浓度咪唑洗脱结果

图4 AMH重组蛋白纯化

2.4 AMH多克隆抗体制备及效价检测

经过4次免疫，获得鼠源AMH抗血清。 使用酶联免疫吸附方法对获得的多克隆抗体血清进行效价测定，结果显示多克隆抗体的效价为2.7×105，可为后续实验提供原材料。

3 讨论

抗缪勒氏管激素是转化生长因子家族成员之一，在哺乳动物中具有调节细胞发育及分化，诱导缪勒氏管退化，维持雄性特征的作用。当前已有较多研究表明，Amh在哺乳动物卵巢发育过程中发挥一定作用。 在硬骨鱼类中，Amh多被当作雄性性别分化关键基因。 尼罗罗非鱼XX个体中，amhy的过表达导致了雌性到雄性的性逆转[9]。 也有研究表明，Amh在雌性个体卵巢发育过程中发挥一定作用。 在黑鲷研究中发现，Amh在卵巢发育早期不表达，在卵黄蛋白原合成期表达量升高[10]。 斑马鱼中的研究发现，Amh缺失会导致雌鱼性腺发育不良，卵泡发生受阻[11]。 这说明，Amh基因在鱼类性腺发育过程中发挥重要作用。

原核表达是外源基因融合表达的方式之一， 具有易培养、生长快、操作简单等优点[12]。 多克隆抗体具有稳定性较好、制备技术要求不高、周期短、成本低等优点，广泛用于蛋白亚细胞定位、蛋白互作、细胞信号通路等研究领域[13]。 本研究利用获得的大口黑鲈Amh基因序列，成功构建pET32a-AMH原核表达载体，诱导出大小为52.3kDa的AMH重组蛋白， 与奥利亚罗非鱼49kDa的AMH重组蛋白[14]及双须骨舌鱼48kDa的AMH重组蛋白[15]大小相近。随后通过免疫小鼠，获得AMH多克隆抗体，利用ELISA对抗体血清进行效价检测，结果显示多克隆抗体的效价为2.7×105，可用于后续研究。

本研究通过构建大口黑鲈AMH原核表达载体，获得AMH重组蛋白，利用重组蛋白对小鼠进行免疫，获得AMH多克隆抗体。 获得的大口黑鲈AMH重组蛋白和多克隆抗体可为后续研究Amh在大口黑鲈中的功能和作用机制提供基础。