基于癌症基因图谱数据库分析Ephrin As在肝癌中的表达及评估肝癌发生的价值

王军军 方雪芬 林秋燕

1.福建省立金山医院检验科，福建福州 350028；2.福建医科大学附属协和医院消化内科，福建福州 350001

原发性肝癌是全球第六大常见的恶性肿瘤，是肿瘤相关死亡的第三大原因，仅次于肺癌和结直肠癌。原发性肝癌根据病理类型分为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、 肝内胆管癌以及混合型， 其中HCC 占75%～85%。肝癌起病隐匿，很多首次确诊的病人往往错过手术切除治疗的最佳时机，建立肝癌早期的诊断模型，对接受早期治疗尤为重要。目前，常用的诊断肝癌血清学标志物敏感度和特异度有限，迫切需要探索诊断效能高、 评估预后价值好的肿瘤标志物。现有药物疗效一般，副作用大，总体的5年生存率低，因此开发新的分子靶向治疗药物与免疫检查点抑制剂药物尤为重要。本研究通过分析癌症基因图谱（the cancer genome atlas，TCGA） 数据库肝癌数据集，寻找有价值的预测肝癌发生的相关基因，为探索新的分子靶向药物提供数据支持，为提高肝癌的诊疗水平提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

进入TCGA 数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/），点击“Repository”，“file”选择“Transpcriptome profilling、HTSeq FPKM”，“case”下选择“Liver and intrahepatic bile ducts、TCGA LIHC、Adenomas and adenocarcinomas”可筛选出一项424 例肝细胞癌转录组数据集，下载肝癌数据集mRNA 表达信息的RNASeq 数据及相应的临床资料。本研究共纳入397 例组织并分成两组：HCC 组[共347 例，其中男236 例，女111 例；平均年龄（58.67±13.83）岁]与正常癌旁组[共50 例，其中男28 例，女22 例；平均年龄（61.68±16.12）岁]。同时根据已下载肝癌数据集的临床分期资料将HCC 组中的347 例分为4 组：Stage Ⅰ（171 例）、Stage Ⅱ（86例）、StageⅢ（85 例）、Stage Ⅳ（5 例）。纳入标准：根据筛选条件进行限定检索所得的数据。排除标准：临床数据和预后数据缺失病例。

1.2 方法

应用R 语言整理肝癌数据集中Ephrin A1～5（EFNA1～5）mRNA 表达量， 并将得到的mRNA 表达量矩阵数据进行对数转换， 比较EFNA1～5 mRNA 表达量在肝癌组与正常癌旁组之间的表达差异。进一步根据肝癌分期Stage Ⅰ～Ⅳ进行分组， 比较其在StageⅠ～Ⅳ组与正常癌旁组之间的表达差异。

1.3 观察指标及评价标准

应用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析单项EFNA1～5 mRNA 预测肝癌发生及肝癌分期Stage Ⅰ～Ⅳ的价值。同时以是否为肝癌患者或者处于肝癌分期Stage Ⅰ～Ⅳ为因变量，以EFNA1～5 mRNA 表达量为自变量，进行二分类logistic 回归分析，建立多项Ephrin As（EFNAs）联合预测指标，采用ROC 曲线分析其预测肝癌发生及肝癌分期Stage Ⅰ～Ⅳ的价值。ROC 曲线检验诊断价值指标标准为：AUC 值＞0.90 表示诊断性能较高，0.71～0.90 表示有一定诊断性，0.50～0.70 表示诊断性能较差。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 EFNAs mRNA 在正常组与HCC 组的表达差异

HCC 组EFNA1、EFNA3、EFNA4 mRNA 表达水平高于正常癌旁组，HCC 组EFNA2、EFNA5 mRNA表达水平低于正常癌旁组，差异有统计学意义（P＜0.01）（图1）。

图1 EFNA1～EFNA5 mRNA 在正常癌旁组与HCC 组的表达差异分析

2.2 EFNAs mRNA 在正常组与HCC 各临床分期组的表达差异

HCC Stage Ⅰ～Ⅳ组EFNA1、EFNA3、EFNA4 mRNA 表达水平高于正常癌旁组，HCC Stage Ⅱ、 Ⅳ组EFNA2 mRNA 表达水平低于正常癌旁组， 差异有统计学意义（P＜0.01）；HCC Stage Ⅰ、Ⅲ组的EFNA2 mRNA 表达水平与正常癌旁组比较， 差异无统计学意义（P＞0.05）；HCC Stage Ⅰ～Ⅲ组的EFNA5 mRNA 表达水平低于正常癌旁组，差异有统计学意义（P＜0.01）；HCC Stage Ⅳ组的EFNA5 mRNA 表达水平与正常癌旁组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图2）。

图2 EFNA1～EFNA5 mRNA 在正常组与HCC Stage Ⅰ～Ⅳ组的表达差异

2.3 EFNAs 单项及多项联合在预测肝癌发生及进展各临床分期价值的比较

2.3.1 单项EFNAs mRNA 预测肝癌发生的价值 ROC曲线分析显示，EFNA1、EFNA3、EFNA4、EFNA5 mRNA 表达水平单项预测肝癌发生的AUC 分别0.712、0.854、0.910、0709 （P＜0.01）；EFNA2 mRNA 表达水平预测肝癌发生的AUC 为0.547（P＞0.05）（图3）。

2.3.2 多项EFNAs mRNA 联合预测肝癌发生的价值为进一步控制EFNA1～5 mRNA 表达量各因素干扰与肝癌发生的关系，以是否诊断为肝癌为因变量（正常为0，诊断为肝癌为1），以EFNA1～5 mRNA 表达量为自变量（连续变量无需赋值），进行多因素logistic 回归分析。结果显示，EFNA3、EFNA4 mRNA 表达量是肝癌发生的独立危险因素（P＜0.01）（表1）。将回归分析模型预值（即EFNA3、EFNA4 联合检测）作为一个新变量与EFNA1～5 mRNA 表达量共同进行ROC 曲线分析，结果显示，联合预测肝癌发生的效能、敏感度、特异度均比单项EFNAs 高（表2，图3）。

图3 EFNA1～5 mRNA 预测肝癌发生的ROC 曲线

表1 EFNA1～5 mRNA 预测肝癌发生的多因素logistic 回归分析

表2 EFNA1～5 mRNA 预测肝癌发生的价值

2.3.3 单项及多项EFNAs mRNA 联合预测肝癌各临床分期的价值 ROC 曲线分析显示， 单项EFNA1、EFNA3、EFNA4、EFNA5 mRNA 表 达 量 在 肝 癌 进 展Stage Ⅰ～Ⅳ均有一定的预测能力；单项EFNA2 mRNA表达量在肝癌进展Stage Ⅱ、 Ⅳ有一定的预测能力（P＜0.01）（表3）。为进一步控制各因素干扰与肝癌各个分期的关系， 分别以是否为诊断肝癌Stage Ⅰ～Ⅳ为因变量（正常为0，诊断为肝癌Stage Ⅰ～Ⅳ为1），EFNA1～5 mRNA 表达量为自变量（连续变量无需赋值），进行多因素logistic 回归分析。结果显示，EFNA3、EFNA4 mRNA 表达量为肝癌进展Stage Ⅰ～Ⅲ的独立危险因素，EFNA1 mRNA 表达量是肝癌进展Stage Ⅱ的独立危险因素（P＜0.05）。将回归分析模型预值（即EFNA1、EFNA3、EFNA4 联合检测） 作为一个新变量与EFNA1～5 mRNA 表达量共同进行ROC 曲线分析，结果显示， 联合预测均比单项EFNAs mRNA 预测效能高，且敏感度、特异度更高（P＜0.01）（表3～4，图4）。因肝癌Stage Ⅳ组病例仅有5 例，不符合logistic 回归分析的要求，故无法建立多项EFNAs mRNA 表达量在肝癌Stage Ⅳ联合预测指标。

图4 EFNA1～5 mRNA 预测肝癌Stage Ⅰ～Ⅳ分期的ROC 曲线

表3 肝癌分期Stage Ⅰ～Ⅳ的二元logistic 回归分析

3 讨论

产生促红细胞生成素的肝癌细胞受体（erythropoietin-producing hepatoma，Eph） 属于已知最大的受体酪氨酸激酶大家族，其在生理及病理过程中发挥着重要作用。在人类中发现了总共14 个Eph 受体，基于氨基酸序列同源性、锚定方式和相对结合亲和力不同，分为EphA 和EphB 两种亚型；Ephrin 配体均为细胞膜结合蛋白， 包含五种糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）方式锚定于细胞膜的EF-NA1～5 和三种单跨膜糖蛋白形式的Ephrin B1～3（EFNB1～3）亚型。Ephrin 配体与Eph 受体结合没有特异性，一种受体或者配体可以与多种配体和受体相结合。目前大量的生物信息学分析表明，多种Eph 受体及其Ephrin 配体在乳腺癌、胃癌、非小细胞癌、结直肠癌、肾癌等肿瘤中表达，且生存分析提示预后不良。有研究指出，Eph 受体及Ephrin 配体相互作用，激活包括Src、RHOA、RAC1、CDC42、STAT3、PIK3/Akt 等信号通路，参与肿瘤的血管新生、侵袭、转移过程。研究显示，EFNA1 在多种肝癌细胞系中与甲胎蛋白表达量呈现正相关，推测其在肝癌的发生及侵袭进展发挥着重要作用。有学者通过蛋白芯片检测发现，EFNA1 mRNA 表达量是肝癌独立的预后因子，其可能是评估肝癌患者术后复发的一项很有价值的指标。EFNA2 在肝癌细胞株及肝癌组织，尤其是侵犯门静脉系统的病例中，蛋白表达水平较高，其可能通过Rac1/Akt/NF-kappaB 信号通路抑制肝癌细胞凋亡，促进肝癌转移。EFNA3 可能与缺氧环境诱导乳腺癌转移的机制有关。有学者通过构建人源肿瘤异种移植模型， 制备EFNA4 抗体的靶向DNA 破坏药物，可以特异性地逆转三阴性乳腺癌和卵巢癌。也有学者提出，miR-96、miR-182 可能作为致癌因子，通过结合EFNA5 mRNA 3'UTR 抑制其蛋白表达， 促进肝癌细胞增殖、迁徙转移。EFNA5 在多种肿瘤中低表达， 且高表达EFNA5 的肝癌患者有更好的总生存率和无病生存率，EFNA5 可作为判断肝癌术后预后的重要标志物。因此，Eph 受体及Ephrin 配体被认为是非常有前途的肿瘤诊断及药物治疗靶标分子。

表4 ROC 曲线评估EFNA1～5 mRNA 预测肝癌各临床分期的价值

本研究基于TCGA 数据库， 分析肝癌数据集中EFNAs mRNA 的表达量， 并结合数据集的临床分期数据，进一步分析肝癌各个临床分期组与正常癌旁对照组之间的差异表达。研究结果显示，HCC 组的EFNA1、EFNA3、EFNA4 mRNA 表达量高于正常癌旁组， 而EFNA2、EFNA5 mRNA 表达量低于正常癌旁组，差异有统计学意义（P＜0.01）。有研究显示，EFNA4表达水平升高与黑色素瘤患者的生存率下降有关，EFNA4 的增强与黑色素瘤的进展有关。有学者利用Oncomine 数据库和GEPIA 数据库研究发现， 肺腺癌中EFNA3 表达上调与较差的临床预后有关， 通过收集临床标本进行免疫组化实验验证EFNA3 的表达量及临床价值， 同时通过细胞实验证明EFNA3 可以提高肺腺癌细胞增殖和糖酵解能力，免疫浸润分析提示EFNA3 与多个免疫治疗生物标志物有关。这些研究都预示着EFNA3、EFNA4 在肿瘤发生及进展中的重要作用。本研究经logistic 回归分析， 筛选EFNA1～5 mRNA 表达量作为肝癌发生的相关因素， 结果显示，EFNA3、EFNA4 mRNA 是肝癌发生的独立危险因素（P＜0.05）， 同时建立多项EFNAs 联合预测肝癌发生的模型。ROC 曲线分析结果显示， 单项及多项联合EFNAs mRNA 在肝癌的发生和各临床分期均有较好的预测价值， 且多项EFNAs 联合预测指标有更好的预测效能。本研究按肝癌临床分期进行分组，与正常组比较分析发现，EFNA3、EFNA4 mRNA 联合预测指标在肝癌Stage Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分组的预测效能明显优于单项EFNAs 的预测能力，其AUC 值均在0.9 以上（P＜0.01），但肝癌组Stage Ⅳ纳入病例数量达不到logistic回归分析统计要求， 无法进行EFNAs mRNA 联合预测模型构建。

综上所述，本研究推断EFNA3、EFNA4 在肝癌的发生及疾病进展中发挥着重要的作用，其具体机制值得深入研究，其可能为今后肝癌早期诊断、预后判断以及靶向治疗提供新方法、 新策略。本研究仅基于TCGA 数据库结合已知的临床数据资料，进行生物信息学分析，结果有一定的局限性，其中因纳入统计的肝癌Stage Ⅳ病例较少，因此后续研究工作可以选择更大的肝癌数据集进行验证，并收集一定数量的临床病例进行研究。