系统性红斑狼疮B细胞差异表达基因生物信息学分析

黄 晶 郜赵伟 郭文涛 董 轲

空军军医大学唐都医院检验科，陕西西安 710038

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是中青年女性常见自身免疫病之一，可累及全身各系统。免疫失调既是SLE患者主要临床表现之一，也是其发生发展的重要驱动要素。SLE患者免疫失调表现多样，包括B细胞[1-2]、T细胞[3]、单核-巨噬细胞[4]等多种免疫细胞异常。其中B细胞免疫异常是SLE研究热点之一。SLE治疗药物Belimumab通过靶向B淋巴细胞刺激因子，抑制B细胞生存及其向浆细胞分化，缓解病情[5]。因此，B细胞异常在SLE发生发展中作用关键。本研究筛选SLE患者B细胞差异表达基因，并进行功能分析，为探讨SLE发病机制和筛选潜在治疗靶点提供参考。

1 资料与方法

1.1 转录组数据集

GSE4588数据集包括7例SLE患者和9例健康者B细胞转录组信息；GSE10325数据集包括14例SLE患者和9例健康者B细胞转录组信息；GSE30153数据集包括17例SLE患者和9例健康者B细胞转录组信息。

1.2 差异表达基因筛选

利用GEO2R分析工具筛选各数据集中SLE患者B细胞差异表达基因（differential expression genes，DEGs），对照为健康者B细胞。DEGs筛选条件：|Log2FC|≥1且P< 0.01，FC：Fold change。通过对3组DEGs取交集得到共有DEGs。

1.3 DEGs功能分析

利用DAVID分析工具对DEGs进行基因本体（GO）注释和KEGG通路分析，利用R软件制作气泡图对GO和KEGG分析结果进行可视化处理。

1.4 蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI）分析

利用STRING在线数据库对DEGs编码蛋白进行PPI构建，筛选联合评分> 0.4的中置信度互作节点数据。

1.5 统计学分析

DEGs利用t检验的P值和差异倍数进行筛选，筛选标准：|Log2FC|≥1及P< 0.01。对DEGs进行GO及KEGG分析，双侧检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 SLE患者B细胞DEGs

根据DEGs筛选标准，分别在GSE4588、GSE30153及GSE10325数据集中筛选到1608（621上调，987下调）、62（56上调，6下调）和366（190上调，176下调）个DEGs（图1A）。取交集后，共筛选到9个 共 有DEGs：USP18、RRM2、OAS3、MAN1A1、IFITM1、IFI44L、IFI44、CD38及CD1C（图1B）。其中，8个基因表达上调，CD1C表达下调（图1C）。

图1 SLE患者B细胞DEGs筛选

2.2 共有DEGs的功能分析

上述DEGs参与的生物学过程（GO_BP）包括：对病毒的响应、病毒防御、病毒基因组复制负调控、Ⅰ型干扰素信号通路。KEGG通路分析显示DEGs参与造血细胞谱系（图2）。

图2 SLE患者B细胞DEGs的GO和KEGG分析结果

2.3 DEGs编码蛋白互作分析

在9个DEGs编码蛋白中：RRM2及MAN1A1与其他7个DEGs无互作关系；CD1C和CD38之间存在互作，与其他7个DEGs无互作；IFI44、OAS3、IFI44L、IFITM1及USP18彼此之间存在互作关系（图3）。

图3 SLE患者B细胞DEGs编码蛋白PPI分析

3 讨论

SLE患者出现抗核抗体、抗dsDNA抗体等多种自身抗体，表明B细胞免疫反应的异常[6-8]。因此，鉴定SLE患者B细胞异常表达基因，对SLE发病机制及治疗靶点研发具有重要价值。本研究共筛选到8个表达上调基因（USP18、RRM2、OAS3、MAN1A1、IFITM1、IFI44L、IFI44及CD38）及1个表达下调基因（CD1C）。其中，IFI44、OAS3、IFI44L、IFITM1及USP18彼此间存在蛋白互作，为核心DEGs。功能分析表明DEGs主要与机体对病毒感染的响应相关。

USP18是一种干扰素信号通路抑制分子，可以特异性地将ISG15从其底物蛋白上切割，从而保护蛋白不受降解。USP18基因多态性与多发性硬化的易感性相关[9]。Yang等[10]研究显示USP18缺失可以上调小鼠体内调节性T细胞（Treg）的细胞分化。由于多项研究表明SLE体内Treg水平显著下调[11-13]，因此，USP18上调可能对SLE发生具有重要作用。然而，B细胞USP18上调的作用尚待进一步研究。RRM2在DNA复制、细胞周期调节中起到关键作用。RRM2在SLE中的作用尚未见报道。本研究发现SLE患者B细胞RRM2表达上调，可能与B细胞的异常增殖活化相关，还需深入研究。

干扰素信号通路在SLE发生发展过程中起到关键作用。本研究筛选的DEGs：OAS3、IFITM1、IFI44L及IFI44均为干扰素诱导蛋白。OAS3可以降解病毒RNA，文献研究[8，14]结果显示，长链非编码RNA—MALAT1可通过上调OAS2、OAS3及OASL促进SLE病情进展，表明OAS3在SLE发生发展中起到关键作用。文献研究[15-16]表明IFI44L甲基化水平在伴有肾损伤SLE患者中显著低于无肾损伤SLE患者，在康复期SLE患者中显著高于活动期SLE患者，表明IFI44L甲基化水平降低可能促进SLE病情进展。由于甲基化水平往往与基因表达水平呈负相关，提示IFI44L表达升高可能促进SLE发展。此外，Shen等[17]报道IFI44可能是狼疮性肾炎（LN）的关键基因，对该病具有一定的诊断价值。Lood等[18]发现SLE患者血小板中IFITM1表达显著上调，并促进血管系统受累，提示IFITM1在促进SLE病情进展中作用关键。

CD38参与核苷酸代谢，目前已有多项治疗肿瘤的CD38靶向药物上市或处于临床试验中[19-20]。研究显示CD38缺失小鼠的自身免疫性炎症水平显著降低，提示CD38可作为控制自身免疫反应的治疗靶点[21]。Cole等[22]研究结果显示，达雷妥尤单抗是一种CD38单抗药物，在体外能够耗尽SLE和类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞中的浆细胞，提示CD38靶向治疗对SLE患者有潜在价值。

CD1C属于非多态性抗原呈递蛋白家族分子，表达于B细胞和树突状细胞。Yuan等[23]研究发现，与健康者相比，SLE和狼疮性肾炎患者体内CD1C+树突状细胞数量显著减少，利用间充质干细胞治疗可以通过增加CD1C+树突状细胞数量，缓解病情。然而，CD1C+B细胞在SLE中的作用尚待进一步研究。

随着高通量测序技术的进步，各类疾病的转录组数据愈加丰富，已成为筛选疾病关键基因和潜在治疗靶点的重要资源。SLE患者临床表现复杂，目前的治疗手段和靶点仍然较少，筛选更多新型治疗靶点对SLE患者具有重要临床意义。本研究利用SLE患者B细胞转录组数据，筛选出9个差异表达基因，为SLE发生发展的分子机制提供理论参考。下一步需要对其中多个基因的功能，尤其是对B细胞免疫的调控作用进行深入研究，以揭示其在SLE发病中的作用及其潜在临床应用价值。