全二维气相色谱-质谱联用技术解析房县黄酒的挥发性成分

刘慧杰，王娟，王忠朝，黄明泉，刘永国*，吴继红，张璟琳

1(北京忠和房县生物食品有限公司，湖北 十堰，442199) 2(中国轻工业酿酒分子工程重点实验室(北京工商大学)，北京，100048)

黄酒是世界上三大古酒之一，也是我国的国酒[1]。房县黄酒历史悠久，起源于周、兴盛于唐，封为“御酒”，故又称“皇酒”[2]。《诗经》中有50多篇文字的记述与房县先民种稻、酿酒、饮酒有关。如《国风·七月》中有“八月剥枣，十月获稻。为此舂酒，以介眉寿”。表明早在3 000年前，房县黄酒就融入了百姓的生产生活当中。此外，房县黄酒是国家地理标志保护产品，其酿造工艺入选省级非物质文化遗产[2]。房县黄酒的酿造以糯米、水为主要原料，经蒸饭，冷却，加当地的小曲进行糖化发酵而成。主要有以下特色：(1)发酵过程不加麦曲，不加酵母，采用糖化回淋工艺；(2)使用当地特色小曲为糖化发酵剂，主要原料是稻米粉和辣蓼草；(3)不加焦糖色；(4)发酵结束即装瓶销售，无需存储，即为新(鲜)黄酒。这些独特的酿造工艺使其具有味甘、色清、气香、力醇的特色。相比于绍兴黄酒的麦香浓厚，房县黄酒的米香更加突出。绍兴黄酒的醇厚是因为绍兴酒讲究窖藏年份，而房县黄酒讲究鲜甜、绵长、爽口。然而，房县黄酒目前仍停留于传统粗放的生产方式，在许多生产环节凭借工人的经验进行。由此产生生产效率低下、产品质量不稳定等问题，制约着房县黄酒的产业发展。

风味是决定消费者接受度的关键因素，也是评价黄酒质量好坏的重要指标。解析黄酒的风味物质基础对黄酒的风味品质调控有重要作用。目前中国大部分地区的黄酒风味成分都已有研究报道。如王培璇等[3]采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用(head space solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)从来自不同地区(江西、广西、广东、浙江、江苏、安徽、福建、上海、山东、辽宁和山西)的12种黄酒中共检测到142种挥发性物质。有学者采用不同的前处理结合香气嗅闻(gas chromatography-olfactometry, GC-O)分析鉴定了绍兴黄酒、福建黄酒、徽派黄酒、代县黄酒中的重要香气活性物质[4-9]。然而，关于房县黄酒风味的研究仍然较少，仅晋湘宜等[10]采用同时蒸馏萃取(simultaneous distillation extraction, SDE)、固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)与液液萃取(liquid-to-liquid extraction, LLE)方法分析了房县传统型、洑汁型和清爽型黄酒的7种挥发性成分，包括乙酸乙酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯和β-苯乙醇。结果显示传统型和洑汁型黄酒风味物质含量最多，清爽型黄酒中各种风味物质含量相对较少。对于房县黄酒风味成分还有待进一步研究。

本论文采用HS-SPME结合全二维气相色谱-质谱联用技术(comprehensive two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry, GC×GC-MS)全面分析房县洑汁、干型黄酒、甜型黄酒中的挥发性成分，旨在揭示房县黄酒香气成分的化学本质，为房县黄酒的质量控制提供参考和科学依据，促进其产业发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验样品：房县发酵3 d的洑汁、干型黄酒(原酒)、甜型黄酒(原酒)样品，北京忠和房县生物食品有限公司。

试剂：C6～C30正构烷烃(色谱纯)，美国Supelco公司；4-辛醇(99.0%)，北京百灵威科技有限公司；NaCl(99.9%)，国药集团化学有限公司。所有标准品纯度大于90%，详见附表1见电子版增强出版链接(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220419.0928.006.html)。

1.2 仪器与设备

7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技公司；SSM1800调制器，雪景电子科技(上海)有限公司；SPME萃取纤维(长2 cm，50/30 μm DVB/CAR/PDMS)、手动固相微萃取手柄，美国Supleco公司；DF-lO1S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器责任有限公司；T-403电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

6.0 μL 4-辛醇(1 000.0 mg/L)作为内标加入至用2.0 g NaCl饱和过的黄酒样品中(6.0 mL)，并将混合液放入顶空瓶(20 mL)中，再将顶空瓶放入45 ℃水浴锅中平衡30 min，插入2 cm灰色萃取头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)萃取30 min，将萃取头插入250 ℃的GC-MS进样口，解析5 min。

1.3.2 感官评价

从实验室招募15名具有感官评价经验的小组成员，将黄酒样品(5.0 mL)装入以3位数字随机编码的酒杯(10.0 mL)中，并随机呈递给评价小组成员，要求评价人员使用6～10个词汇描述黄酒样品的香气感官特征，然后根据描述词汇的频率高低确定黄酒的最终风味轮廓。最终米香、烤香、醇香、花香、果香、甜香、酸香、糟香和烤香9种香气特征被确定为房县黄酒的香气轮廓，采用1～9分强度法对每个香气轮廓的强度进行打分，其中设置1～3分为弱，4～6分为中等，7～9分为强，评价方法参考GB/T 19547—2004《感官分析 方法学 量值估计法》。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：第一根色谱柱为J&W DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；第二根色谱柱为J&W DB-17MS(1.0 m×0.18 mm×0.25 μm)；调制柱为C5～C30的HV系列。升温程序：初温50 ℃，保持3 min，再以6 ℃/min的速度升至240 ℃，并保持10 min；调制器：进口热区温度为初温110 ℃，保持3 min，再以6 ℃/min升到300 ℃，保持10 min；出口热区为170 ℃，保持3 min，再以6 ℃/min升至320 ℃，保持15 min；冷区温度为-50 ℃；调制周期为4 s/1 s。载气(He，99.999%)流速2.0 mL/min，不分流。

1.3.4 质谱条件

电子轰击(EI)离子源；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度250 ℃；质量扫描范围m/z40～450。

1.3.5 定性分析

采用NIST14(National Institute of Standards and Technology)谱库检索(匹配度大于700)、保留指数(retention index，RI)和标准品比对进行定性分析。

RI定性[11]：在相同的色谱条件下，分别将样品与正构烷烃(C6～C30)前后进样进行分析，RI的计算如公式(1)所示，并与文献报道的RI对比，将绝对值相差30以内的确定为同一化合物。

(1)

式中：n和n+1分别为未知化合物流出前后正构烷烃碳原子数；t为未知化合物保留时间；tn和tn+1为相应正构烷烃的保留时间(tn

1.3.6 定量分析

采用内标法定量，通过样品中各组分的峰面积与内标峰面积的比值和样品中各组分浓度与内标浓度比值，求得各挥发性成分的含量。

1.3.7 数据分析

采用Origin Pro 9.1进行雷达图和柱状图的绘制；采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(邓肯检验)；偏最小二乘法(partial least squares regression, PLSR)分析采用XLstat 2016；热图聚类分析采用TBtools v 1.082。

2 结果与分析

2.1 香气感官评价分析

对发酵3 d的洑汁、干型黄酒和甜型黄酒定量描述性分析，结果如图1所示。房县黄酒的香气主要为米香、醇香、花香、果香、甜香、酸香、糟香和烤香。对感官评价结果进行单因素方差分析发现，米香、醇香、花香在3个样品中存在极显著差异。发酵3 d的洑汁米香和甜香突出，干型黄酒有较强的花香和醇香，甜型黄酒的烤香、酸香、果香比较强烈。而绍兴黄酒则是醇香、焦糖、果香、烟熏、曲香、药香、蜂蜜香较为突出[4]；以黍米为原料的代县黄酒的香气以糟香、米香、蜂蜜、酸香、焦糖、酱香、醇香、陈香、曲香为主，其中糟香最浓[9]。相比之下，浓郁的米香、果香、花香形成了房县黄酒的特色香气。

2.2 挥发性成分定性分析

HS-SPME萃取是将石英纤维置于待测样品上方的气相中吸附挥发性成分，提取过程无需溶剂，集萃取、吸附、富集、洗脱和进样于一体，提取过程快速、简单[12]。对房县发酵3 d的洑汁、干型黄酒原酒、甜型黄酒原酒进行了HS-SPME结合GC×GC-MS分析，结果如附表2(见电子版增强出版附件：https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220419.0928.006.html)，发酵3 d的洑汁、干型黄酒、甜型黄酒中共鉴定出205种挥发性成分，包括酯类63种、醇类46种、酸类10种、醛类17种、酮类25种、酚类5种、内酯类8种、缩醛9种、烯烃类9种、呋喃类5种、含硫类8种。其中，有85个化合物是首次在黄酒中被检出，其中59个化合物经标准品定性。

如图2所示，发酵3 d的洑汁样品中共鉴定出139种挥发性成分，干型黄酒中鉴定出140种，甜型黄酒鉴定出137种。其中，3种黄酒共有的有82种，干型黄酒特有的有25种，甜型黄酒特有的有25种，发酵3 d的洑汁特有的有26种。在干型和甜型黄酒中都有，但发酵3d样品中没有的有16种；在干型和发酵3d中都有，但甜型黄酒中没有的有17种；在甜型和发酵3d中都有，但干型黄酒中没有的有14种。

图2 三种不同房县黄酒样品的挥发性成分的 Venn图分析结果Fig.2 Venn diagram analysis results of volatile components among three Fangxian Huangjiu

此外，由图3可以看出，发酵3 d的洑汁中醛类、酮类、呋喃类和烯烃类化合物的数量最多；干型黄酒的酯类、醇类数量最多；甜型黄酒中酸类、内酯类最多；酚类在3种酒中一样多，酮类和缩醛类的数量在干型和甜型黄酒中一样多。

图3 三种不同房县黄酒中各类挥发性化合物的数量图Fig.3 The number of various volatile compounds among three Fangxian Huangjius

值得注意的是，在房县黄酒的挥发性成分中有23种物质据文献报道有健康功效。包括4种酯类：乙酸乙酯能加速新陈代谢功能制约乙醛，乳酸乙酯可促进乙醇刺激大脑皮层的作用，使人兴奋，己酸乙酯能降低肺火，稳定心肺的作用，亚油酸乙酯在体内水解后生成脂肪酸，可抑制胆固醇合成[13]；7种酸类：乙酸、丁酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸是维持肠道和免疫稳态的主要参与者[14]；还有8种萜烯类及其衍生物具有抗癌，抗炎，抗病毒，抗氧化活性等保健或药物作用[15]，其中伯克哈拉杜烯，石竹烯、蛇麻烯、(-)-α-依兰油烯、δ-杜松烯、α-荜茄醇、3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯-1-醇都是首次在黄酒中被报道，D-柠檬烯只在小米和黍米黄酒中有报道[16-17]；此外，糠醇具有抗癌和抗氧化活性[18]；二甲基二硫是内源性抗氧化物，具有减少细胞氧化应激损伤和延长动物寿命的作用，可能在内源性抗氧化防御体系中扮演重要角色[19]；3-甲硫基丙醇具有抗氧化活性，还可抑制α-葡萄糖苷酶的活性，降血糖功能[20]；4-乙烯基愈创木酚有降低血糖、抗炎活性[13]。

2.3 挥发性成分定量分析

如附表2所示，发酵3 d的洑汁挥发性成分总相对含量最多(20 859.32 μg/L)，其次是干型黄酒(16 008.70 μg/L)和甜型黄酒(14 153.89 μg/L)。

黄酒中的醇类产生主要有2种途径：一种是通过Ehrlich途径由氨基酸转化而来；另一种是通过糖酵解途径合成(Harris途径)[21]。在前期的研究中已有报道，3-甲基-1-丁醇(呈醇香和果香)和β-苯乙醇(呈甜香和花香)对黄酒的糟香和甜香有重要贡献[9]。在房县黄酒中，3-甲基-1-丁醇和苯乙醇都是在发酵3 d的洑汁中的含量(质量浓度为4 630.16和3 252.79 μg/L)高于干型黄酒(质量浓度为2 334.67和2 694.30 μg/L)和甜型黄酒(质量浓度为1 928.02和1 484.27 μg/L)。

酯类通常贡献果香、甜香和花香[9]，主要由代谢过程中葡萄糖和氨基酸产生的醇与酸在酯酶催化下反应形成的[21]，在发酵3 d的洑汁、干型黄酒、甜型黄酒中酯类物质的质量浓度依次是4 716.39、5 089.56和4 896.41 μg/L。乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯在红曲黄酒中被鉴定为关键香气成分[5]，乳酸乙酯在代县黄酒中被鉴定为对糟香有显著贡献的成分[9]。乙酸乙酯在发酵3 d的洑汁中质量浓度最高，为1 224.28 μg/L，其次是干型黄酒(978.60 μg/L)，甜型黄酒中质量浓度最低(897.78 μg/L)；乙酸异戊酯的质量浓度在干型黄酒中最高(409.31 μg/L)；乳酸乙酯和丁二酸二乙酯的质量浓度在甜型黄酒中最高，分别是334.79和1 308.11 μg/L。这些化合物中，除了乙酸异戊酯的含量与红曲黄酒(135.89～239.36 μg/L)相近，其他物质的含量均低于红曲黄酒及绍兴黄酒中的含量[5,8]，如在红曲黄酒中乙酸乙酯质量浓度为7 605.07～1 639 960 μg/L、乳酸乙酯质量浓度为5 875 894～32 024 917 μg/L、丁二酸二乙酯质量浓度为150 101～12 371.54 μg/L[5]。这可能由于房县黄酒是新鲜的黄酒，而其他地区的黄酒经过陈酿酯类物质含量增加[8]。

乙酸和3-甲基丁酸对黄酒的酸香有重要贡献[8-9]。乙酸在发酵3 d的洑汁中质量浓度较高，为1 189.46 μg/L，其次是甜型黄酒971.71 μg/L，干型黄酒中质量浓度最低，为686.91 μg/L。3-甲基丁酸在发酵3 d的洑汁中质量浓度较高，为176 06 μg/L，甜型黄酒中质量浓度最低，为122.76 μg/L。乙酸和3-甲基乙酸在房县黄酒中的含量低于绍兴黄酒和黍米黄酒中的含量[8-9]。

在发酵过程中醛类物质大部分是通过氨基酸的脱氨和脱羧作用产生的[21]，大多数醛类物质呈青香，如壬醛、庚醛等[9]。有研究表明，壬醛对黄酒的熟粮香有重要贡献[22]，壬醛在发酵3 d的洑汁中质量浓度(868.67 μg/L)高于干型黄酒(249.07 μg/L)和甜型黄酒(70.68 μg/L)。且壬醛在房县黄酒中的质量浓度较高，如在红曲黄酒中质量浓度仅为5.42～8.68 μg/L[5]，绍兴黄酒中仅为21.9～27.7 μg/L[7]。据之前的研究报道，在绍兴黄酒(150～5 560 μg/L)[8-9]、小米黄酒(415.21～11 226.44 μg/L)[14]、红曲黄酒(783.7～1 263.7 μg/L)[5]中，苯甲醛是含量最高的醛类物质，呈苦杏仁味，它在房县黄酒中的质量浓度为146.11～160.15 μg/L。此外，目前已报道对黄酒香气有重要贡献的醛类化合物还有香兰素[8-9]，然而，香兰素在房县黄酒中并未被检出。

缩醛类物质主要贡献果香和甜香[8]。乙缩醛(呈果香)在甜型黄酒中的质量浓度882.73 μg/L高于发酵3 d的洑汁470.80 μg/L和干型黄酒371.21 μg/L，但它们的含量都低于绍兴黄酒(15 800～134 000 μg/L)[8]。还有8种缩醛在黄酒中首次被报道，包括1,1-二乙氧基-2-甲基丙烷、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊环、1,1-二乙氧基-3-甲基-丁烷、1,1-二乙氧基戊烷、1,1,3-三乙氧基丙烷、1,1-二乙氧基-壬烷、1,1-二乙氧基癸烷、(2,2-二乙氧基乙基)苯。因此，可推测房县黄酒中丰富的缩醛类化合物可能也是造成其果香、甜香突出的重要因素之一。

此外，对黄酒香气影响较大的还有酚类(159.55～429.14 μg/L)、内酯类(17.02～165.90 μg/L)和含硫类化合物(159.55～429.14 μg/L)[8-9]。酚类物质主要呈烟熏味、木香等，主要来源于羟基肉桂酸、阿魏酸和对香豆酸的脱羧反应[21]。房县黄酒中检出苯酚、4-乙基苯酚、4-乙基愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、2,4-二叔丁基苯酚，这些物质在绍兴黄酒和福建红曲黄酒中都有报道[5,8-9]。据陈双[4]报道，4-乙烯基愈创木酚在绍兴黄酒中被鉴定为重要的香气活性物质，贡献木香和烟熏味，质量浓度在125～2 750 μg/L，然而，4-乙烯基愈创木酚在房县发酵3 d的洑汁中质量浓度仅为32.99 μg/L，在甜型和干型中质量浓度更低，分别为7.35和1.53 μg/L。这与感官评价结果一致，绍兴黄酒中有较浓的烟熏味，而房县黄酒中几乎感受不到该香气。

内酯类物质主要来源于美拉德反应和发酵过程中的酵母代谢[23]，主要贡献黄酒中的焦糖香和甜香。在之前的研究中，呈奶香的γ-壬内酯和呈焦糖味、药香的葫芦巴内酯在绍兴、代县等地区的黄酒中是最重要的内酯类化合物[8-9]，被鉴定为关键香气成分。γ-壬内酯在房县黄酒中的质量浓度为10.73～13.99 μg/L，低于浙江(250.16 μg/L)[24]、上海(57.36 μg/L)[24]、代县(52.59 μg/L)[9]等地区的黄酒；然而，葫芦巴内酯在房县黄酒中未被鉴定出。这与感官评价结果一致，房县黄酒中几乎没有焦糖味和药香，这可能由于房县黄酒是新鲜的黄酒，而葫芦巴内酯是黄酒在陈酿过程中产生的[8]。

含硫类化合物由于其较低的阈值，对食品的香气有重要贡献。3-甲硫基-1-丙醇呈典型的煮土豆味，在发酵3 d的洑汁中的质量浓度为129.04 μg/L，大于干型黄酒(94.06 μg/L)和甜型黄酒(56.30 μg/L)。与绍兴黄酒4 233.06～31 069.19 μg/L[8]、代县黍米黄酒652.04 μg/L[9]和小米黄酒258.17～334.82 μg/L[13]等相比，3-甲硫基-1-丙醇在房县黄酒中的含量较低。

2.4 香气与挥发性骨架成分相关性分析

为了明晰房县黄酒挥发性骨架成分与香气特征的关系，选取在3个样品中质量浓度最大的30种挥发性成分与香气属性做PLSR相关性分析。变量投影重要性(variable importance in projection，VIP)>1.0的化合物可认为是导致样品间差异的重要因素[25]。如图4所示，乙酸乙酯、壬醛、3-甲基-1-丁醇、1-丙醇、乙酸苯乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基丁酸、4-乙基苯酚、1-辛烯-3-醇、丙酸乙酯、3-甲基丁醛、3-甲硫基-1-丙醇、β-苯乙醇、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯的VIP>1.0，说明它们是潜在的导致不同类型房县黄酒香气差异的重要化合物。

图4 挥发性骨架成分在3个样品间的变量投影重要性Fig.4 Variable importance in projection (VIP) of volatile skeleton components among three Fangxian Huangjius

此外，将骨架成分与香气特征的相关系数进行聚类分析，结果如图5所示，红色表示正相关，蓝色表示负相关，圆圈越大表示相关系数越大。可见，β-苯乙醇、3-甲硫基-1-丙醇、丙酸乙酯、3-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇、4-乙基苯酚、乙酸乙酯、壬醛、3-甲基-1-丁醇、1-丙醇、3-甲基丁酸、2-甲基-1-丙醇、乙酸苯乙酯与米香和甜香呈显著正相关，而与其他香气呈负相关。另外，丁二酸二乙酯、乳酸乙酯、乙酸异戊酯、4-辛酮、十五酸乙酯与酸香、果香、糟香、醇香呈显著正相关，而与米香和甜香呈负相关。其中，β-苯乙醇、乳酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、3-甲基丁酸在前期报道中已被证实为黄酒中的关键香气成分[5,8-9]。且已有研究表明β-苯乙醇呈典型的甜香和花香，对黄酒的甜香有显著贡献；乳酸乙酯虽然阈值高，但对糟香有显著贡献。这都与本研究结论一致。值得注意的是，丁二酸二乙酯仅在房县甜型黄酒中含量较高且与酸香、果香、糟香、醇香呈显著正相关，因此，丁二酸二乙酯在房县黄酒中的作用值得进一步研究。

图5 感官特征和挥发性骨架成分相关性热图Fig.5 Heat map analysis of the correlation between the sensory characteristics and main compounds

3 结论

本研究采用感官评价和HS-SPME结合GC×GC-MS鉴定出房县发酵3 d洑汁、干型黄酒、甜型黄酒中205种挥发性成分。发酵3 d的洑汁挥发性成分的含量最多，其次是干型和甜型黄酒。相关性分析发现，β-苯乙醇、3-甲硫基-1-丙醇、丙酸乙酯、3-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇、4-乙基苯酚、乙酸乙酯、壬醛、3-甲基-1-丁醇、1-丙醇、3-甲基丁酸、2-甲基-1-丙醇、乙酸苯乙酯与米香和甜香呈显著正相关，丁二酸二乙酯、乳酸乙酯、乙酸异戊酯、4-辛酮、十五酸乙酯与酸香、果香、糟香、醇香呈显著正相关。本研究有望为房县黄酒的酒体质量控制提供理论支撑。此外，挥发性化合物对香气的影响与基质、化合物之间的相互作用有很大关系，房县黄酒中的关键香气化合物及其香气间的交互作用值得进一步研究；值得注意的是，房县黄酒中有丰富的萜烯类物质，它们对房县黄酒的香气贡献以及健康功效贡献可进行下一步研究。