烟台地区猪源大肠杆菌分离鉴定及耐药性分析

●宋庆华（山东省烟台市蓬莱区村里集畜牧兽医站 山东 烟台 265612）

大肠杆菌对仔猪危害性较大，感染仔猪会出现腹泻、脱水、生长缓慢等症状，甚至突发死亡，由于仔猪免疫力较低，还易感染其他细菌、病毒等，进而影响生猪正常发育，同时大肠杆菌引发的仔猪黄、白痢还具有传染性，不利于仔猪健康成长[1]。为保障生猪正常生长和出栏，许多养殖场和散养户在生猪养殖过程中定期使用抗生素药物进行疾病防治，但长期用药或过量使用均可造成抗生素药物在生猪体内残留，不仅影响猪肉产品质量，还会因粪尿排泄中含有抗生素破坏土壤和生态环境[2]。因此，合理选择抗生素治疗，缩短用药时间，降低细菌耐药性问题尤为重要。本试验通过采集山东烟台某猪场腹泻病料，经过细菌分离培养、革兰氏染色、生化鉴定和药敏试验建立猪源大肠杆菌耐药谱，为临床合理选用防治药物提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2021年11月初在山东烟台某养猪场对出现腹泻症状的生猪进行肛拭样本采样，共采集132例样本。

1.2 试剂与仪器

磷酸盐缓冲液、普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基、伊红美兰琼脂培养基、革兰氏染色液试剂盒、氧氟沙星、诺氟沙星、庆大霉素、氯霉素、链霉素、氨苄西林、卡那霉素、头孢他啶、阿米卡星、头孢噻肟、头孢唑啉、环丙沙星、氨曲南、头孢哌酮、哌拉西林等药敏纸片购自北京索莱宝科技有限公司。葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、七叶苷、山梨醇、蛋白胨水、MR-VP培养基、吲哚、尿素、硫化氢、苯丙氨酸、西蒙氏枸橼酸盐、克氏柠檬酸盐等细菌生化反应管购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

精密电子天平（型号：JA2603B，上海精科天美仪器有限公司），恒温培养箱（型号：JH-100A，青岛景弘环保科技有限公司），光学显微镜（型号：BA310Digital，麦克奧迪实业集团有限公司），超净工作台（型号：SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 病原菌的分离培养将肛拭样本与100 μL磷酸盐缓冲液（pH 7.2～7.4，无菌）均匀混合，浸泡1 h后，取50 μL混合溶液分别均匀涂布于普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板上，37℃培养约20 h，从麦康凯琼脂平板挑取单菌落置于SS琼脂平板和伊红美兰琼脂，相同条件下培养后观察细菌生长状态。

1.3.2 革兰氏染色和形态观察从麦康凯琼脂平板挑取菌落制成涂片，利用革兰氏染色法进行染色，置于光学显微镜下观察细菌颜色、形态。

1.3.3 生化试验按生化反应管操作说明进行细菌生化鉴定。

1.3.4 药敏试验按照药敏纸片（扩散法）说明书对分离的病原菌进行药敏试验。将纯化细菌液制成1×108CFU/mL悬液，无菌条件下吸取100 μL，均匀涂布到普通琼脂平板上，然后用无菌镊子将药敏纸片轻轻放置到琼脂表面，在37℃培养20 h后测定抑菌圈直径，判断病原菌对药物的敏感性。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离和初步鉴定

132例样本中共分离到猪源大肠杆菌86株，猪源大肠杆菌在普通琼脂平板上可见圆形、光滑的白色菌落，在麦康凯琼脂平板上可见圆形、光滑的玫红色菌落，在SS琼脂平板上可见圆形、光滑的红色菌落，在伊红美兰琼脂上可见圆形、有金属光泽的深褐色或黑色菌落。革兰氏染色结果显示涂片上有红色、短小杆菌。

2.2 生化试验结果

生化试验结果，见表1。

表1 分离菌株的生化试验结果

将分离纯化的细菌进行生化鉴定（表1），结果发现细菌在葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、阿拉伯糖生化试管中可产酸、产气，在七叶苷、VP、尿素、硫化氢、苯丙氨酸、西蒙氏枸橼酸盐、克氏柠檬酸盐的试验结果为阴性，在山梨醇、蛋白胨水（色氨酸肉汤）、MR、吲哚的试验结果为阳性。参照文献[3]，与大肠杆菌的基本生化特性相符。

2.3 药敏试验结果

分离菌株的药敏试验结果，见表2。

表2 分离菌株的药敏试验结果

如表2所示，从抗生素类别来分析，上述菌株对青霉素类（耐药比例为66.28%～80.23%）、氨基糖苷类（耐药比例为43.02%～82.56%）、喹诺酮类（耐药比例为37.21%～68.60%）具有一定的耐药性。而对头孢类、单酰胺环类、氯霉素类药物表现出不同程度的敏感，对头孢唑啉（敏感比例为97.67%）、头孢哌酮（敏感比例为96.51%）、氨曲南（敏感比例为84.88%）、氯霉素（敏感比例为94.19%）高度敏感。从细菌的多重耐药性来分析，耐药率超过60%的抗生素药物共有7种，表明猪场在防治生猪腹泻时存在多重耐药问题。

3 讨论

猪肉一直居于我国生肉消耗量的首位，猪场产品的安全性同消费者日常饮食安全密切相关。大肠杆菌是伴随人畜生产生活的一种条件性致病菌，动物机体的肠道组织内存在少量大肠杆菌，气温骤变、卫生不良、应激刺激等均可造成大肠杆菌大量繁殖，进而出现一系列炎症反应。

由于大肠杆菌是引发生猪细菌性腹泻的主要病原体之一，且属革兰氏阴性菌，对其进行耐药性试验还能侧面反映仔猪副伤寒、猪肺疫、猪布氏杆菌病、猪放线菌病等革兰氏阴性菌株的药物敏感问题。

耐药菌株主要和抗生素用量、使用频率有关。从细菌耐药性来看，主要包括单一抗生素耐药和多重耐药现象。孙慧琴等[4]分离鉴定了443株猪源大肠杆菌，发现大肠杆菌对8种抗生素的耐药率超过70%，对5种抗生素的耐药率超过90%。邓珊珊等[5]对某规模化猪场猪源大肠杆菌进行分离株药敏试验和耐药基因PCR检测，发现猪源大肠杆菌对氨苄西林、环丙沙星、青霉素等抗生素存在耐药性问题，PCR结果显示9种耐药基因均能检出，表明猪场存在大肠杆菌耐药性和多重耐药问题。本试验发现，分离获得的猪源大肠杆菌对氨苄西林、庆大霉素、链霉素、诺氟沙星的耐药率超过65%，表明猪场存在多重耐药问题，但对氯霉素这种禁用抗生素的敏感性较高，表明猪场对国家规定的生猪养殖禁用药存在认知，但对其他非禁用抗生素的使用仍存在不合理性。

为保障猪肉产品安全，有关部门需要加大猪肉产品耐药性监测，以防因猪肉产品的药物残留导致食用者出现肠道菌群失调和过敏反应等。李荣等[6]研究发现，育肥猪日粮中添加0.5%益生菌可提高盲肠中的乳酸杆菌数量，减少腹泻发病率。蓝婧婷等[7]研究发现保育猪饲料为80%基础日粮+20%发酵饲料的，仔猪腹泻率显著下降了74.35%，且血清中的IgM含量显著提高了100%。邓位喜等[8]研究发现仔猪日粮中添加复方杜仲中草药发酵制剂，腹泻发生率降低了11.67%，且仔猪日增重提高了6.02%。因此，建议猪场和养殖户生产中使用益生菌、发酵饲料、中草药添加剂等减抗和替抗产品，促进生猪健康养殖。

4 结论

本试验通过对检出的86株猪源大肠杆菌进行检测，结果显示该猪场的大肠杆菌病原体对7种抗生素药物的耐药率超过60%，对头孢唑啉、头孢哌酮、氨曲南和氯霉素（禁用药）高度敏感，以上结果可为生猪大肠杆菌感染的治疗提供用药参照。同时建议使用益生菌等减抗替抗产品，促进生态健康养殖。