化妆品中三种致敏香料GC-MS 检测方法的研究与建立

李杰，吉伟佳，杨婷婷，易路遥

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

市场上化妆品产品推陈出新，琳琅满目，每种化妆品所含的化学组分更是种类繁多［1］，其中香料是化妆品使用较多较广的一类添加剂，然而随着近年来化妆品的广泛使用，化妆品的不良反应报道也随之增加［2］，据不完全统计，因为使用化妆品的原因而产生的各种不良反应至少有35%是因为香料导致的［3］。

随着大量试验数据和过敏案例的积累，香料中的新铃兰醛、苔黑醛及氯化苔黑醛［4-6］这三种物质逐渐被列入各个国家和地区的化妆品禁用物质目录，欧盟委员会在2017 年8 月2 日发布了（EU）2017/1410 号法规［7］，以及我国国家药品监督管理局在2021 年5 月28 日发布公告（2021 年第74号）［8］，均将新铃兰醛、苔黑醛、氯化苔黑醛列为化妆品禁用物质。

目前国内仅刚刚出台了新铃兰醛的检验标准，现有国内文献［9-13］中有用气质联用法检测塑料玩具中致敏性芳香剂、气质联用法检测化妆品中苔黑醛及氯化苔黑醛，HPLC-MS 法测定香料类过敏原物质残留量等可供参考，但同时检测这三种香料的方法暂无；国外检测标准有［14-16］欧盟CEN/TC 347 EN 16274:2012 消费品中香料过敏原的气质联用检测方法，包括新铃兰醛Ⅰ（CAS 31906-04-4），但未包括新铃兰醛Ⅱ（CAS 51414-25-6）以及苔黑醛及氯化苔黑醛。

本研究改进了相关标准和文献方法的样品提取，采用新型通过式SPE 柱作为净化手段，对方法提取溶剂，净化过程等进行改进优化，并对方法的基质效应，回收率，线性关系，检出限，定量限等方法学指标进行评价，结合通用广且能确证的气相色谱-串联质谱法（GC-MS）技术［13］，建立适用于化妆品基质检测三种致敏香料新铃兰醛、苔黑醛及氯化苔黑醛含量的定性定量方法。

1 试验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 7890A/5975 气相色谱质谱联用仪（Agilent 公司，美国），XS205DU 电子天平（METTLER TOLEDO，瑞士），ML204 电子天平（METTLER TOLEDO，瑞士）；DB-17MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm，Agilent 公司，美国）；离心机（Thermo Fisher公司，美国）；涡旋混合器（IKA 公司，德国）。

新铃兰醛对照品（批号：111528，新铃兰醛Ⅰ∶新铃兰醛Ⅱ=72∶28），来源：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；苔黑醛对照品（批号：D494613），来源：上海洽姆仪器科技有限公司；氯化苔黑醛对照品（批号：BCBW0256），来源：Sigma 公司；甲醇（色谱纯），来源：Sigma；无水Na2SO4（分析纯），来源：国药集团；SHIMSEN Qvet-HP（2 g/6 mL），来源：日本岛津。

8 批婴幼儿护肤类化妆品（护肤霜4 批、润肤乳4 批），8 批面膜类化妆品（保湿面膜、美白面膜等），爽肤水2 批（控油爽肤水等），均为市售所得。

1.2 方法

1.2.1 标准储备溶液的制备精密称取新铃兰醛标准物质0.1 g（精确至0.1 mg，均为新铃兰醛同分异构体的混合对照品，按照归一化法新铃兰醛Ⅰ∶新铃兰醛Ⅱ=72∶28 换算各自的浓度，样品中测得新铃兰醛总量以新铃兰醛Ⅰ和新铃兰醛Ⅱ之和计），苔黑醛标准品0.1 g（精确至0.1 mg），氯化苔黑醛标准品0.1 g（精确至0.1 mg）至10 mL 棕色容量瓶中，甲醇定容，得到浓度为新铃兰醛Ⅰ7.2 mg/mL 和新铃兰醛Ⅱ2.8 mg/mL、苔黑醛7.66 mg/mL、氯化苔黑醛10 mg/mL 的标准储备溶液，置于4 ℃避光保存。临用时分别取上述标准储备溶液适量，用甲醇稀释成标准曲线溶液。

1.2.2 样品前处理精密称取1.0 g 试样置于10 mL容量瓶中，加入约5 mL 甲醇溶液，于超声波清洗仪上超声20 min，再用甲醇定容至10 mL，混匀，转移至离心管中以8 000 r/min 高速离心10 min，取适量上清液通过2 g 无水Na2SO4脱水，取脱水后的溶液2 mL 置通过式SPE 小柱，直接收集流出液，经0.22 μm 滤膜过滤,滤液作为待测溶液。

阴性样品基质溶液：取阴性样品按上述方法制备。

1.2.3 色谱-质谱条件色谱柱DB-17MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），色谱条件：初始温度为100 ℃，保持1 min 后以10 ℃/min 速率升至200 ℃；然后以5℃/min 速率升至260 ℃；再以10 ℃/min 速率升至280 ℃，保持5 min。载气：高纯氦气，流速为1.0 mL/min；进样口温度为280 ℃；进样模式为分流进样，分流比5∶1。质谱条件均为：离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，传输线温度280 ℃ ；离子化方式为EI；电离能量为70 eV。

新铃兰醛Ⅰ定量离子136，定性离子192、105；新铃兰醛Ⅱ定量离105，定性离子118、163；苔黑醛定量离子151，定性离子106、152；氯化苔黑醛定量离子 185，定性离子186。

2 结果

2.1 方法学验证

2.1.1 基质工作标准曲线精密量取适量“1.2.1”中各标准物质储备溶液，用甲醇稀释至适当浓度的标准物质中间使用溶液，再用按照“1.2.2”的制备方法得到的阴性样品基质溶液配制对应的基质工作标准曲线，标准物质新铃兰醛Ⅰ的浓度范围为0.36 μg/mL～10.80 μg/mL，新铃兰醛Ⅱ为0.14 μg/mL～4.20 μg/mL，苔黑醛为0.19 μg/mL～5.75 μg/mL，氯化苔黑醛为0.50 μg/mL～15.00 μg/mL。以目标化合物的定量离子色谱峰峰面积为纵坐标，对应的标准物质浓度为横坐标作图，绘制标准曲线。三种物质在其标准曲线范围内，峰面积与浓度值呈现的线性关系良好，相关系数均大于0.990 0，线性范围和相关系数见表1。

表1 基质标准曲线的回归方程、线性范围和相关系数

2.1.2 精密度取标准曲线溶液中新铃兰醛Ⅰ0.36 μg/mL、新铃兰醛Ⅱ0.14 μg/mL、苔黑醛0.19 μg/mL、氯化苔黑醛0.50 μg/mL 溶液与新铃兰醛Ⅰ10.80 μg/mL、新铃兰醛Ⅱ4.20 μg/mL、苔黑醛5.75 μg/mL、氯化苔黑醛15.00 μg/mL 溶液，各连续进样6 次，计算峰面积的RSD 作为低、高浓度标准溶液的日内精密度。计算结果RSD 均小于10%，满足实验要求。

2.1.3 回收率及重复性试验实验选取了霜、乳液、粉剂和液体剂4 种典型的化妆品样品作为基质本底，分别添加了1 倍定量限（低）、2 倍定量限（中）、10 倍定量限（高）3 个添加浓度，按前述“1.2.2”处理，分别平行制备5 份，经测定并计算结果可知，方法对于不同化妆品基质，霜剂的回收率在72.5%～99.5%之间，乳剂的回收率在72.3%～98.7%之间，粉剂的回收率在70.5%～125.4%之间，液体剂的回收率在85.6%～111.7%之间，RSD 均小于10%。

2.1.4 方法的检出浓度和最低定量浓度向霜剂、乳液、粉剂和液体的空白基质中定量添加三种待测组分，按“1.2.2”处理后，测定信噪比为3∶1 时，添加的化合物的量为方法检出浓度；测定信噪比为10∶1 时，添加的化合物的量为方法最低定量浓度。经测定，检出浓度为新铃兰醛Ⅰ1.1 mg/kg、新铃兰醛Ⅱ 0.4 mg/kg、苔黑醛0.6 mg/kg、氯化苔黑醛1.5 mg/kg；最低定量浓度为新铃兰醛Ⅰ3.6 mg/kg、新铃兰醛Ⅱ1.4 mg/kg、苔黑醛1.9 mg/kg、氯化苔黑醛5.0 mg/kg。

2.2 样品测定

采用上述方法对8 批婴幼儿护肤类化妆品，8批面膜类化妆品、爽肤水2 批开展了分析。样品按“1.2.2”处理并测定，结果显示，其中1 批婴幼儿护肤霜类化妆品检出新铃兰醛34.3 mg/kg。儿童婴幼儿护肤类化妆品中存在添加致敏香料情况，需引起重视，婴幼儿一直都是高风险人群［17］，是安全问题的易发区，鉴于我国刚刚于今年5 月更新《化妆品禁用原料目录》［8］，婴幼儿护肤类化妆品的香料添加使用情况需要重点关注。

3 讨论

3.1 色谱质谱条件的选择和优化

在色谱条件优化过程中，我们针对气相毛细管色谱柱的极性强弱进行了对比，选择了不同液膜厚度的HP-5MS 毛细管柱（0.25 μm、1.0 μm），DB-17MS 毛细管柱，DB-WAX 毛细管柱及HP-FFAP毛细管柱对三种标准品溶液进行分析，其中HP-5MS 和DB-17MS 对三个目标化合物分离最为合适，且出峰峰形较好，HP-5MS 液膜厚1.0 μm 比0.25 μm 的分离度更好，而针对三种致敏香料的分离时长来看，HP-5MS 毛细管柱对其分离耗时较DB-17MS 毛细管柱更长，故最终将DB-17MS 作为分离色谱柱。

在升温条件优化过程中，我们比较了多个文献［14-21］的方法：若选择起始温度为60 ℃，会导致三个目标物分离度不好且出峰时间较长，因此，我们通过抬高色谱柱DB-17MS 的初始的温度，优化升温程序，使目标物在12 min 内即可出峰完全，且分离度良好，最后快速抬高温度至280 ℃进行杂质扫尾，三个目标物的总离子流图详见图1。

图1 GC/MS仪器条件下3种香料的总离子流图

质谱条件的优化通过GC-MS 在SCAN 模式下对新铃兰醛、苔黑醛及氯化苔黑醛标准储备溶液进行扫描，确定了各自的定性定量离子。

3.2 样品提取溶剂的选择

化妆品前处理提取溶剂常用的有甲醇和乙腈，综合考虑适用范围和气相色谱分离手段，甲醇极性大，基质的适用性更好一些，且乙腈在气相色谱分析中一般较少使用，加之甲醇毒性稍弱一点，因此最后选择了甲醇作为提取溶剂，同时增加无水硫酸钠脱水处理步骤，最后为保护气相毛细管色谱柱避免甲醇的溶解损伤，设置了分流比进样［17］。

3.3 净化方案的优化

3.3.1 SPE 柱的选择为了快速且有效地净化样品提取液，结合文献［17］采用通过式SPE 小柱来进行净化，为了选择合适的固相萃取柱建立专属性好的前处理净化方案，我们选择了不同品牌不同填料的SPE 柱，PRiME HLB（200 mg/6 mL）、PRiME MCX（200 mg/6 mL）、SHIMSEN Qvet-NM（2 g/6 mL）及SHIMSEN Qvet-HP（2 g/6 mL）。分别进行4 种设计分析：标准物质溶液直接过柱、样品基质溶液直接过柱、样品基质溶液过柱后添加标准物质、样品基质溶液添加标准物质后再过柱。实验选用霜剂、乳剂、粉剂和液体4 类化妆品作为考察基质，标准物质过柱前和过柱后的添加量均使得最后标准物质上机溶液浓度为5 μg/mL。结果显示，标准物质溶液直接过柱实验中，三个目标物SHIMSEN Qvet-HP平均回收率为95.1%、SHIMSEN Qvet-NM 平均回收率为81.7%、PRiME MCX 平均回收率为43.5%、PRiME HLB 平均回收率为43.5%。样品基质溶液直接过柱实验中，SHIMSEN Qvet-NM 和SHIMSEN Qvet-HP 去除干扰效果较好，PRiME HLB、PRiME MCX 次之，液体基质的3 款柱子杂峰去除干扰效果SHIMSEN Qvet-HP 要优于SHIMSEN Qvet-NM，PRiME HLB、PRiME MCX 效果次之。样品基质溶液过柱后添加标准物质和样品基质溶液添加标准物质后再过柱的实验中，通过样品基质溶液添加标准物质再过柱测得的目标物峰面积与样品基质溶液过柱后添加标准物质测得的目标物峰面积之比计算回收率，通过计算，SHIMSEN Qvet-HP 回收率为85.0%～95.0%、SHIMSEN Qvet-NM 回收率为78.0%～86.0%、PRiME HLB 回收率为80.0%～90.0%，PRiME MCX 回收率为40.5%～46.0%。

综上，可选择SHIMSEN Qvet-HP（2 g/6 mL）作为净化柱。同时进一步结合基质效应实验结果综合选择最优的净化柱。

3.3.2 基质效应实验基质效应（ME）的计算［17］等于“3.3.1”方案设计中样品基质添加标准物质过柱后测得目标物的峰面积与对应浓度的标准物质溶液的峰面积的百分比再减去100%，若计算结果为负，则为基质效应抑制，若计算结果为正，则为基质效应增强。实验结果显示，PRiMEMCX对霜剂和乳剂的基质效应有较强抑制（-68.1%～-45.0%），SHIMSEN Qvet-HP 有略微基质效应增强（21.0%～9.0%），PRiME MCX 对粉剂和液体的基质效应为一般抑制，PRiME HLB 和SHIMSEN Qvet-HP 为略微增强。

综上，最终选择SHIMSEN Qvet-HP（2 g/6 mL）作为净化柱。

4 结论

香料是化妆品中常见的配料之一，香料过敏会引起包括过敏性接触性皮炎，刺激性接触性皮炎等各种过敏反应，导致皮肤红肿、脱屑和角质化等，长期还会引起皮肤皲裂、苔藓化和角质化过度等严重症状。部分商家为吸引消费者而添加的各种香料会带来潜在的过敏风险，因此有必要针对化妆品中常见致敏香料物质进行风险评估。

本研究建立了化妆品中三种致敏香料新铃兰醛、苔黑醛和氯化苔黑醛的GC-MS 测定方法。对色谱、质谱条件及样品提取净化方案进行了改进优化，完成了基质效应及方法学验证等评价，该分析方法前处理简单，高效准确，选择性好，可用于化妆品中三种致敏香料含量的测定分析。