苓桂术甘汤对慢性心力衰竭大鼠心肌功能及心室重构的影响

寇林利，赵明君，魏明明，李莹超

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712021)

慢性心力衰竭(Chronic heart failure,CHF)是心内科常见疾病，各种心脏疾患晚期均会出现心功能失代偿相关表现，CHF是目前威胁人类健康的重要公共卫生问题，全球心力衰竭患者已超过6000万例，且心衰的发病率与年龄呈正相关，每增加10岁发病率随之翻一番，且预后差，病死率高[1-3]。现代医学认为CHF发病以心室重构为主要机制，临床对其干预措施主要为减缓心室重构进程，缓解患者症状，提高生活质量。中医认为“心衰”系心病日久，心络“虚”“瘀”相兼，久则发为以“心悸兼喘息不能平卧，咳吐痰涎，尿少水肿”为主症的脱证。临床研究表明，苓桂术甘汤通过多机制、多靶点改善心衰患者症状及预后，临床应用广泛[4-8]。二维斑点追踪技术(Two dimensional speckle tracking echocardiography，2D-STE)通过测量标准动态二维图像的应变，建立二维灰阶图像分析声学斑点运动轨迹来定量评价局部和整体心肌功能的无创检测技术[9]。本课题旨在通过引入二维斑点追踪成像技术定量评价苓桂术甘汤治疗慢性心力衰竭大鼠模型的心肌运动情况，探讨苓桂术甘汤改善慢性心力衰竭大鼠心室重构机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：SPF级SD大鼠[许可证号SCXK(川)2020-030),成都达硕实验动物公司]5～7周，共44只，体重190～220 g。纳入实验的大鼠均在陕西中医药大学动物实验中心喂养，给予普通饲料及饮用水饲养7 d后开始用于实验。

1.1.2 实验主要试剂：苓桂术甘汤由陕西中医药大学附属医院自制；注射用盐酸多柔比星(批号2020080714)；地高辛(批号123191105)；ELISA 试剂盒(批号L211021127)；Masson染液套装(批号G1006)；中性树胶(批号10004160)。

1.1.3 实验主要仪器：正置光学显微镜及成像系统(日本尼康公司)；脱水机(Diapath公司)；包埋机(武汉俊杰电子有限公司)；高速组织研磨仪(Sercicebio公司)；台式高速冷冻离心机(大龙公司)；酶标检测仪(BioTeK公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 药品制备：苓桂术甘汤由茯苓20 g，桂枝、白术各15 g，炙甘草10 g组成，于12倍纯水中浸泡30 min后按照1∶8比例加水，煎煮2次药液，1000 r/min，10 min离心，取上清，浓缩至浓度为1 g/ml，存放于4 ℃冰箱备用。

1.2.2 心电图采集：受检大鼠连接心电图，取左侧卧位并调整导联使心率平稳后，暴露左室长轴切面，采集心尖四腔及左室短轴乳头肌，连续5个心动周期水平切面的二维动态图像并保存，帧频180～200帧/s。

1.2.3 二维超声心动图检查：于心尖四腔心切面使左室最大程度暴露，记录大鼠各组左室射血分数(Left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短轴缩短率(Fraction shortening，FS)、左室舒张末内径(Left ventricular end-diastolic internal diameter，LVIDd)、左室收缩末内径(Left ventricular end-systolic internal diameter，LVIDs)相应数值。

1.2.4 2D-STE检查：于上述1.2.2采集的二维动态图像中勾勒出心尖左心长轴切面上左室心内膜、中段及心外膜大致轮廓，若与实情不符，则可手动调整心内膜及心外膜边缘曲线，使其宽度尽量与实际一致。自动分析左室室间隔的兴趣区域，使用软件分析心尖四腔心切面图像,测量并计算各节段平均总应变值,获得左心室室间隔二维应变参数(绝对值)、二维斑点纵向应变绝对值(GLS)等相关指标以评估左室收缩功能。上述检查均由两位经验丰富的超声医师根据美国超声心动图协会制定的超声心动图规范化操作流程[10]完成，所有数据均重复测量3次，取平均值。

1.3 心衰模型建模方法 配比液：将10 mg注射用盐酸多柔比星于5 ml灭菌注射用水中混匀，加入0.9%氯化钠溶液稀释浓度至2 mg/ml。对需要建模的大鼠给予2 mg/kg的配比液腹腔注射，2次/周，共4周。空白组给予同体积0.9%氯化钠溶液。定期观察并记录大鼠的行为、毛发色度、液体出入量等变化，初步评判CHF造模是否成功。造模1周之内各组分别行心脏超声，取得病理学切片，Masson染色后镜下对比观察，进一步明确CHF模型是否成功建立。

1.4 分组及干预 将大鼠随机分成空白组、模型组、地高辛组、苓桂术甘汤组，各11只。根据人与大鼠体表面积换算公式，苓桂术甘汤组、地高辛组分别以6.25 g/(kg·d)、0.027 mg/(kg·d)为剂量标准灌胃,空白组、模型组给予等体积0.9%氯化钠溶液，连续灌胃4周。每周称重1次并记录，同时为尽量排除昼夜节律的影响因素采取固定时间灌胃。

1.5 血液学指标检测 各组大鼠在灌胃4周后于心尖部取血，静置30 min，2000 r/min，离心30 min，取上清，-80 ℃储存。ELISA实验中取适量样本，室温解冻，以ELISA试剂盒检测，记录各组大鼠血浆B型脑钠肽(B brain natriuretic peptide，BNP)、血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，Ang-Ⅱ)及内皮素1(Endothelin 1，ET-1)水平。

1.6 Masson染色心肌组织 采血完成后尽快取出心脏，0.9%氯化钠溶液灌流至组织表面颜色灰白，固定于4%多聚甲醛过夜，常规无水乙醇、包埋、切片，Masson染色，镜下对比观察各组大鼠心肌纤维化程度，采集图像保存分析。

2 结 果

2.1 一般情况 造模过程中发现空白组大鼠精神状态佳，毛色正常无脱落，食水量、二便均正常，活泼好动，由于互相撕咬死亡2只，重新分笼后无死亡发生。模型组大鼠在造模第1周时出现饮食、饮水量逐渐减少，造模第2周活动逐渐减少，表现为安静、嗜卧，部分大鼠毛发逐渐粗糙、变黄及脱落；造模第3周时出现体重下降，四肢末梢冰凉，皮肤苍白，毛发脱落，尤以双耳后及颈部毛发脱落较甚，大便较稀软，大鼠鼻部及眼角出现红色分泌物；造模第4周模型组大鼠出现腹部膨隆表现。各组直至灌胃给药结束后大鼠存活情况：空白组9只，模型组7只，地高辛组、苓桂术甘汤组，每组6只。

2.2 各组大鼠心肌组织病理学形态改变 通过Masson三色法染色分析，并计算胶原纤维面积占左心室组织面积的百分比后发现，与空白组比较，模型组、地高辛组、苓桂术甘汤组纤维化程度均较高；与模型组比较，地高辛组、苓桂术甘汤组纤维化程度均低；苓桂术甘汤组纤维化程度低于地高辛组(图1)。

A：空白组；B：模型组；C：地高辛组；D：苓桂术甘汤组图1 各组大鼠心肌组织病理学形态(Masson染色，×200)

2.3 各组大鼠二维超声结果比较 造模结束1周后对各组大鼠行心脏二维B超。与空白组比较，模型组大鼠的LVEF、FS、LVIDd、LVIDs均明显改变，主要表现为LVEF、FS的显著降低和LVIDd、LVIDs升高(图2)。

A：空白组；B：模型组图2 造模1周后二维超声判定建模成功

给药4周后，各组大鼠超声检查结果，见表1。模型组大鼠LVEF、FS值均低于空白组,LVIDd、LVIDs则高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。苓桂术甘汤组、地高辛组LVEF、FS值均高于模型组，LVIDd、LVIDs均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。LVEF、FS、LVIDd、LVIDs在地高辛组与苓桂术甘汤组间比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

表1 各组大鼠超声心动图相关指标比较

二维超声结果提示，模型组大鼠心功能受损，左室舒张功能及收缩功能均受到一定程度损害，药物治疗后的大鼠心功能均得到一定程度改善，但较空白组仍有差距。

2.4 各组大鼠血清BNP、Ang-Ⅱ及ET-1比较 见表2。模型组大鼠BNP、Ang-Ⅱ、ET-1均高于空白组，差异有统计学意义(均P<0.05)。地高辛组、苓桂术甘汤组BNP、Ang-Ⅱ、ET-1均低于模型组，差异有统计学意义(均P<0.05)。苓桂术甘汤组ET-1低于地高辛组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠血清BNP、Ang-Ⅱ及ET-1水平比较(ng/L)

2.5 各组大鼠2D-STE应变参数比较 见表3。模型组室间隔二维应变参数各节段绝对值均低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。地高辛组、苓桂术甘汤组室间隔二维应变参数各节段绝对值均高于模型组，差异有统计学意义(均P<0.05)。地高辛组室间隔二维应变参数基底段、心尖段绝对值均高于苓桂术甘汤组，差异有统计学意义(均P<0.05)。各组大鼠给药4周后给予二维斑点结果，与空白组相比，模型组GLS的绝对值较低；与模型组相比，地高辛组、苓桂术甘汤组GLS绝对值较高；与苓桂术甘汤组比较，地高辛组GLS绝对值升高(图3)。

表3 各组大鼠心脏室间隔2D-STE应变参数比较

A：空白组；B：模型组；C：地高辛组；D：苓桂术甘汤组图3 各组大鼠给药4周后二维斑点结果图

2.6 各指标相关性分析 Pearson相关性分析发现，BNP与GLS之间存在显著相关性(r=-0.9447,P<0.01)；Ang-Ⅱ与GLS之间存在显著相关性(r=-0.9251,P<0.01)，ET-1与GLS之间存在显著相关性(r=-0.9186,P<0.01)。

3 讨 论

心肌损伤是CHF发生发展的主要环节，而抵抗各种损伤的修复机制主要表现为心室重构[11-12]；目前认为心室重构主要包括心肌肥大和心肌纤维化[13-14]，是心肌针对机械或者神经刺激做出的代偿性反应，微观方面表现为心室心肌细胞及间质的重构，宏观方面以心室扩张和心功能衰退为主[15]。数据显示仅以心衰“金四角”，即ACEI/ARNI、β受体阻滞剂、MRA和 SGLT2抑制剂为主要方案的西医治疗对心衰的反复住院率及远期疗效并不明显[16-19]。而中医认为心阳不足是心衰的主要病机，且心阳乃阳中之太阳，可振奋一身之阳[20-21]。因此，心阳虚可逐渐导致肺、脾、肾三脏阳气皆虚，影响其相应生理功能，首当其冲是全身津液代谢失调发为水肿，苓桂术甘汤作为经典的健脾利水、温阳蠲饮方剂，在CHF治疗中效果可观，方中重用茯苓健脾利水渗湿，为君药；配伍桂枝温心阳以制肾水，助心阳以平冲降逆,通心阳以消阴翳之痰饮，同时达到温补肺、脾、肾三脏，且能祛除里实；白术合茯苓加强培土制水之功,为佐药；并使以炙甘草辛甘化阳，助药效发散。全方共奏助阳化气之功,使邪从小便而利[22]。

当左心室负荷量及心脏形态改变时应用二维超声心动图对心脏结构与功能的评价存在一定局限[23]。本研究所用的2D-STE可以对心肌组织进行定量分析，通过获取兴趣范围的心肌组织灰阶并自动逐帧追踪此区域内声学斑点位置、心动周期中的信息对目标位置心肌运动情况进行分析，并对大鼠心肌组织进行图像创建，最终获得牛眼图。此图像中主要涉及到心肌组织的运动、形变及应变角度、位移、速度等多方面心肌力学参数，精准辨别心肌不同节段的异常运动情况[24-26]。此结果可最大程度排除心脏整体运动、室壁运动夹角、声束方向等因素的干预。在心动周期中，心肌发生的应变显著表现在径向、纵向及圆周运动三个矢量方向，通常以心肌纵向应变为主要参考[27-28]。2D-STE检查目前仍存在一定技术局限：其一，心肌运动一般在三维空间观察其形态变化，而该检查技术仅检测了心肌纵向、径向及周向的二维形变情况，而无法全面跟踪斑点运动轨迹的空间位置[29-31]；其二，该诊断技术对图像质量要求极其严苛，必须采取完整的心肌内、中、外三层膜，而通常高分辨率的二维图像可以将心肌节段运动进行有效追踪，并掌握整个检查时间段患者的心肌运动情况[32-34]。

本研究结果提示，慢性心衰大鼠经地高辛、苓桂术甘汤治疗后心功能均得到改善，但地高辛组和苓桂术甘汤组血清学LVEF、FS、LVIDd、LVIDs、BNP、Ang-Ⅱ比较均无统计学意义，而从左心室二维斑点追踪显像来看，地高辛组室间隔二维应变参数基底段及心尖段绝对值较高，且GLS绝对值也高于苓桂术甘汤组；从病理学分析来看，地高辛组总治疗效果优于苓桂术甘汤组。通过将血清学指标BNP、Ang-Ⅱ及ET-1与GLS进行Pearson相关性分析，其结果验证了苓桂术甘汤通过调控RAAS系统来改善左室心肌收缩功能以减轻心室重构，延缓心衰进程。2D-STE技术对局部心肌运动的定量评价验证了苓桂术甘汤调控神经内分泌因子改善心肌收缩力，在慢性心力衰竭诊断及疗效判定中有重要意义。