嗅三针对蛛网膜下腔出血并发认知障碍大鼠海马神经元及Caspase-3表达的影响

2022-09-14 07:19王祯芝张美玲
陕西中医 2022年9期
关键词:三针蛛网膜下腔

王祯芝,张美玲,熊 康,王 渊,王 强,周 锋

(1.陕西中医药大学,陕西 咸阳 712046;2.陕西中医药大学附属医院,陕西 咸阳 712021)

蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)指脑底部或脑表面的病变血管破裂,血液直接流入蛛网膜下腔引起的一种临床综合征,约占急性脑卒中的10%,具有高发病率和高病死率的特点[1-2]。患者通常可出现认知障碍,严重影响患者日常功能、生活质量[3]。海马神经元损伤是认知障碍(Cognitive impairment,CI)的核心问题,蛛网膜下腔出血并发认知障碍是海马神经元凋亡及增殖调控失常的结果[4]。目前,临床对CI并无较好的治疗方法,常用以盐酸多奈哌齐为主的替代性疗法,虽然对本病有一定治疗效果,但存在长期服用疗效减退及不良反应多等不足。因此,减缓海马神经元损伤,改善SAH并发认知障碍的临床表现,提高患者生活质量为首要目标。近年来,嗅三针作为治疗神经退行性疾病的特色疗法效果较好[5-6]。本实验采用蛋白质印迹法、实时荧光定量PCR技术,通过观察半胱氨酸蛋白3(Caspase-3)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)蛋白在大鼠海马组织的表达情况,探讨嗅三针疗法对蛛网膜下腔出血大鼠认知障碍及Caspase-3、PI3K、AKT蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:以60只清洁级雄性SD大鼠为研究对象,平均体重(250±20)g。大鼠购自西安交通大学实验动物中心,饲养于陕西中医药大学动物实验中心SPF级清洁鼠房,动物处理遵循《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.1.2 实验药物与试剂:尼莫地平(北京星昊医药股份有限公司);PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT、Caspase-3抗体和二抗(湖北雪瑾生物技术有限公司);PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。

1.1.3 实验仪器:一次性针灸针(苏州医疗用品厂有限公司);Vonfrey仪(上海玉研科学仪器有限公司),酶标仪、离心机(均为美国Thermo Fisher公司),电泳仪、凝胶成像仪、定量PCR仪(均为美国Bio-Rad公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组、建模及干预:取60只成年SD雄性大鼠,随机分为五组,即空白组、模型组、嗅三针组、尼莫地平组、假针刺组,每组12只。除空白组外,其余组采用经视交叉池注血制备SAH模型,手术方法参照文献[7]。术前将手术器械严格灭菌处理。动物适应性喂养1 d后,禁水24 h,称重后,用2%戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉。待大鼠充分麻醉后,将大鼠俯卧位固定,头顶剃毛,口齿固定低于双耳杆平面3.6 mm,碘伏消毒,于顶部成10 mm×20 mm皮瓣,暴露前后囟,于前囟前2.5 mm、中线旁1.3 mm钻孔,《大鼠立体定向图谱》示此孔位于前颅窝底与额极交界处,显微镜下挑破软脑膜,见清亮脑脊液溢出,即为蛛网膜下腔,将连接微量注射器的胶管头由双耳连线中点处,紧贴前颅底蛛网膜下腔置入约1.1 cm,其顶端至Willis环前,注入股动脉血300 μl,随后缝合皮肤。术中注意观察大鼠呼吸、心跳等情况。待大鼠苏醒后,送回鼠笼正常饲养。嗅三针组干预方法:取两侧迎香及印堂穴。迎香穴位于大鼠鼻孔外侧上端,有毛与无毛交界处;印堂穴位于大鼠两眼眶上缘中点连线与正中线交点。电针方法:迎香穴向内上方斜刺0.2 cm,印堂向鼻根部平刺0.2 cm;正极接印堂,负极接一侧迎香,刺激10 min,负极换接另侧迎香,刺激10 min。电针参数:疏密波,频率为2 Hz,强度为2 mA。疗程:1次/d,5 d为1个疗程,休息2 d,共进行4个疗程。空白组、模型组予嗅三针组相同时间、相同程度的捉抓刺激。假针刺组:即双迎香穴及印堂穴各偏后0.5 cm处,按照嗅三针组时间留针,不做其他干预。

1.2.2 荧光定量PCR检测大鼠海马区Caspase-3、PI3K、AKT mRNA表达:新鲜组织加入Trizol液氮研磨,加入氯仿提取,DEPC双蒸水沉淀总RNA,紫外分光光度计检测总RNA浓度、纯度,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。在荧光定量PCR仪上进行反应,并根据Q-PCR试剂盒和扩增条件,分3个阶段。将RNA反转录为cDNA,以cDNA为模板,并设置质量控制[8]。将标准品DNA稀释后分别进行基因扩增,计算建立标准曲线及数据收集(5’-3’)。引物序列:β-actin的上游引物为5’-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’,下游引物为5’-TACATGGCTGGGGTGTTGA-3’;Caspase-3的上游引物为5’-GTACAGAGCTGGACTGCGGTATTG-3’,下游引物为5’-AGTCGGCCTCCACTGGTATCTTC-3’;AKT的上游引物为5’-GGCAGGAGGAGGAGACGATGG-3’,下游引物为5’-TTCATGGTCACACGGTGCTTGG-3’;PI3K的上游引物为5’-CTGTGCCTTCTGCCTTACGGTTG-3’,下游引物为5’-GCAATCGTCGTGGCGTCCTTC-3’。

1.2.3 Western blot检测Caspase-3、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT蛋白表达:取大鼠脑组织加入RIPA裂解液与PMSF,两者体积比例100∶1,在无菌环境下,冰上研磨30 min,于4 ℃、12000 r/min条件下离心,15 min后取上清液置于离心管-80 ℃储存。分离样品蛋白,制备分离胶与浓缩胶,根据蛋白浓度计算上样量进行蛋白上样,随后进行SDS-PAGE电泳1.5 h,在转膜缓冲液中转移至PVDF膜,将其放置于5%脱脂奶粉封闭液,室温封闭1 h,于4 ℃冰箱分别置于Caspase-3、p-PI3K、p-AKT一抗中孵育过夜,TBST洗膜5 min,共3次;加二抗Goat anti Mouse IgG(H+L)HRP(1∶800),避光室温孵育1 h,TBST洗膜5 min,共3次;使用化学发光试剂显影后,用BIO-RAD Quantityone图像分析软件进行扫描,分析Caspase-3、p-PI3K、p-AKT的灰度值,GAPDH为内参蛋白。

2 结 果

2.1 各组大鼠海马区Caspase-3、PI3K、AKT mRNA表达比较 见表1。与空白组比较,模型组海马区PI3K、AKT、Caspase-3 mRNA表达水平升高,差异有统计学意义(均P<0.05)。与模型组比较,嗅三针组和尼莫地平组海马区PI3K、AKT mRNA表达均升高,且嗅三针组高于尼莫地平组,差异有统计学意义(均P<0.05)。与模型组比较,嗅三针组和尼莫地平组Caspase-3 mRNA表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠海马区Caspase-3、PI3K、AKT mRNA表达比较

2.2 各组大鼠海马区Caspase-3、PI3K、AKT蛋白表达比较 见表2(图1)。与空白组比较,模型组海马组织PI3K、AKT蛋白表达量降低,Caspase-3蛋白表达量升高,差异有统计学意义(均P<0.01)。与模型组比较,尼莫地平组、嗅三针组PI3K、AKT蛋白表达量均升高,Caspase-3蛋白表达量降低,差异有统计学意义(均P<0.05)。

表2 各组大鼠海马区Caspase-3、PI3K、AKT蛋白表达比较

图1 各组大鼠海马区Caspase-3、PI3K、AKT蛋白表达电泳图

3 讨 论

SAH并发认知障碍属中医“中风”“健忘”“痴呆”等范畴。中医学认为本病病位在脑,病机为神机失用、脑髓空虚。《灵枢·刺节真邪篇》记载针刺治疗本病:“泻其有余,补其不足,阴阳平复,用针若此,疾于解惑”,故临床治疗脑卒中患者认知功能障碍以醒脑通络,解郁活血为主。针灸作为中医特色治疗方法,通过针刺患者的特定穴位,具有醒脑开窍,活血化瘀的功效[9]。针灸治疗本病选择种类多样,本研究所采用的嗅三针是由刘智斌教授创立治疗神经退行性病变的特色电针疗法,已广泛运用临床多年,疗效较好。嗅三针由印堂、迎香穴组成,印堂乃督脉奇穴,而督脉为“阳脉之海”,可“入络脑”,刺之可调理督脉达醒脑之效;迎香属手、足阳明经交会穴,可调阳经,刺之可宣通阳明达开窍之功。诸穴合用可益智开窍,改善脑部血液微循环,有助于提升认知功能和日常生活能力[10]。针刺治疗CI具有独特优势,临床研究发现嗅三针治疗可调节海马区血液循环的血液流变学指标,通过调节血管舒缩功能,改善患者全身血液循环,减低血液黏度,增加脑组织血液供应,促进脑细胞功能恢复,畅通记忆、学习、执行等环路[11-13]。实验研究发现,嗅三针能够显著增强CI大鼠学习记忆功能,提高海马ChAT和AchE活性,提高痴呆大鼠海马ChAT、SOD的活性[14-15]。

正常情况下,海马神经元向大脑皮层存取记忆,形成认知过程[16],故海马神经元是认知功能的核心。蛛网膜下腔出血后血性脑脊液会长期损害海马组织[17-19],改变大脑内微环境,导致海马神经元凋亡加速[20]。病理学证实,过度凋亡是蛛网膜下腔出血海马神经元损伤的主要形式,抑制凋亡可以保护大鼠脑组织[21-23]。临床发现抗神经元凋亡治疗对CI患者并未取得预期效果[24]。实验进一步证实,单纯提高蛛网膜下腔出血大鼠体内具有抗凋亡作用的蛋白激酶B表达,凋亡改善并不明显,而神经干细胞(NSCs)增殖可以抑制大鼠神经元凋亡,保护脑组织[25]。有研究表明,SAH大鼠受损脑组织中成纤维生长因子(bFGF)水平增高[24],而bFGF主要存在于海马组织,具有调控神经元凋亡,促进神经发育及修复功能。大量研究表明,bFGF通过增加PI3K/AKT通路活性而抑制细胞凋亡。

本实验结果表明,嗅三针对蛛网膜下腔出血大鼠神经保护作用的主要机制可能是通过激活大鼠脑组织PI3K/AKT信号通路,抑制Caspase-3蛋白表达,从而抑制细胞凋亡,减轻神经组织的炎性损伤。本实验为嗅三针临床诊疗早期CI提供了思路和依据。针灸治疗SAH并发认知障碍虽处于初期探索阶段,但在改善症状及提高患者生活质量等方面具有明显优势。因此,临证时应重视中西医结合的治疗方式,联合用药,提高临床疗效。

猜你喜欢
三针蛛网膜下腔
综合护理对蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的临床干预分析
智三针介导JNK信号通路对体外循环大鼠的脑保护作用与机制研究
1例右心房至第二肝门的下腔静脉损伤患者的急救措施探索
剧烈头痛?
颈三针合肩三穴治疗颈肩肌筋膜疼痛综合征的临床研究
蛛网膜下腔出血后为什么容易再出血?
黑河市爱辉区 注入“三针”强效提升党建活力
针灸大师
麻醉前加温输液对蛛网膜下腔麻醉患者中心体温及寒战的影响
脑出血的几点认识