植物中滞绿基因的研究进展

郭 恒 叶广继 纳添仓 王 舰 周 云 *

（1青海省农林科学院，青海西宁 810016；2青藏高原生物技术教育部重点实验室，青海西宁 810016）

颜色的变化通常为判断果实成熟的标准，绿色植物衰老和果实成熟的显著标志是叶绿素降解和叶绿体转化为色质体。然而，有些植株在生长末期还保持原有的绿色，未出现黄化或者出现很少的黄化现象，这是由于叶绿素降解很少。这种叶片或果实在成熟期仍然保持绿色的现象称之为“滞绿”[1]。滞绿蛋白（stay-green proteins，SGR）作为核基因编码叶绿体的靶蛋白，结构高度保守，其表达在叶绿素降解和器官衰老方面至关重要[2]。到目前为止，很多研究人员已经在多种植物中发现了滞绿突变体，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）[3]、水稻（Oryza sativa）[4]、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）[5]、草甸羊茅（Festuca pratensis）[6]、高粱（Sorghum bicolor）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、番茄（Solanum lycopersicum）[7-8]、辣椒（Capsicum annuum）[9]、 烟 草 （Nicotiana tabacum）、 香 蕉 （Musa AAA group）[10-11]、大豆（Glycine max）[12]等。Thomas等[13]通过叶绿素含量和光合速率的变化，将滞绿突变分为5种类型。延迟叶片衰老时间的A型，如玉米突变体fs855[13]；减缓叶绿素降解速率的B型，如高粱突变体R16[14]；抑制叶绿素降解的C型，如番茄gf突变体；受到自然或非自然影响后植物组织遭到破坏而叶绿素不发生降解的D型，如风干的标本及有病虫害的农作物；植物虽然衰老但是叶绿素还能保持很长时间的E型。以上5种类型可以分为两类，A型和B型属于功能型滞绿突变，它们在衰老时期叶绿素未发生降解，叶片保持绿色，能进行较长时间的光合作用，因而被认为有可能提高作物产量；C型、D型和E型属于非功能型滞绿突变，它们在维持滞绿性状的同时，光合能力的下降速率和野生型相同，只是叶绿素降解受到影响。除了D型是由于外界刺激造成的以外，其他4种都有可能与其内源性基因调控有关。

在水稻滞绿突变体中分离出NYC1和NYC1-LIKE蛋白后[15-16]，在其他突变体中分离出了叶绿素降解的相关基因[16-20]。叶绿素降解途径被阻断或者抑制，使得叶绿素降解途径不能继续而发生滞绿。此外，部分茄科植物已经成功克隆分离了SGR基因，并且在实践生产中应用良好，但是在马铃薯中对于SGR的研究还较少。本文主要梳理和总结近年来SGR基因的研究进展，探讨SGR在马铃薯上的应用前景和未来发展。

1 植物滞绿突变

植物的成熟、衰老是自然界中的普遍规律，叶绿素是植物光合作用的重要工具，其降解受到抑制后，叶片、种子等器官会出现滞绿现象。孟德尔经典实验中把控制豌豆子叶颜色（黄色/绿色）的位点命名为I，该位点突变后不仅在种子成熟过程中子叶保持绿色，在衰老过程中叶片也保持绿色。1962年，Steinbuch等提出，蚕豆的持绿性对其成熟的程度和多样性有作用，进而影响蚕豆最终产量、等级和品质。随着对滞绿性状的研究，滞绿性也成为评价玉米产量优势的重要指标和商业营销手段。Robson等[21]将玉米衰老增强启动子和IPT基因（IPT基因编码细胞分裂素合成的一个限速酶）转入玉米中，发现转基因植株在衰老期合成大量细胞分裂素而表现出常绿性状。同时，将来源于拟南芥的衰老特异启动子SAG12和IPT基因连接，发现转基因烟草也能观察到滞绿现象[22]。通过RNA干扰技术将拟南芥SGR基因沉默后，拟南芥植株会出现不同程度的滞绿现象。此外，在水稻、高粱等多种植物中均发现了叶片滞绿突变体[6]，在番茄、大豆等植物中也同时发现了果实和种子表现滞绿性状的突变体。这些突变体在叶片衰老期或果实、种子成熟过程中仍然保留着较多的叶绿素，使器官呈现出区别于野生型的颜色。

目前，对于植物滞绿的研究主要围绕着叶绿素新陈代谢路径和其相关基因对于植物滞绿性的影响、叶片发育过程中光合作用和氮元素转运对于叶片滞绿性的影响以及逆境条件对于植物滞绿性状的影响等。影响植物滞绿性的因素很多，其中外因主要包括光周期现象、各种环境胁迫等，内因主要包括生理上滞绿现象和叶绿素的合成降解、离子转运、植物激素调控、转录因子及microRNA调控等。滞绿突变体的形成原因是多方面的，外界特定环境的影响是一个不可忽视的因素，但表型不能遗传，所以对植物本身可遗传因素的研究更加重要。一方面，叶绿素降解代谢过程是由多个酶促反应完成的，代谢途径中任何一种酶的活性受到抑制或相关基因发生变异，都会引起叶绿素降解受阻而出现滞绿现象。例如，在草甸羊茅滞绿突变体中，脱镁叶绿素a加氧酶PAO的活性显著低于野生型，被认为是其表现滞绿性状的主要原因。另外，PAO酶活性减弱也已被证明是多数C型突变体（如豌豆、菜豆等）滞绿的关键因素。除PAO以外，叶绿素b还原酶、羟甲基叶绿素a还原酶活性降低或缺失也会导致叶绿素降解受阻引起滞绿[23-24]。另一方面，Efrati等[25]在研究中发现辣椒cl滞绿突变体和番茄gf滞绿突变体，2个同源基因突变可能是二者滞绿表型形成的原因；进一步分析认为，突变基因并非叶绿素降解代谢途径中关键酶的结构基因，而可能是调控基因。Kerr通过对番茄滞绿突变体gf遗传连锁关系进行分析发现，滞绿性状是由单一隐性核基因控制，该基因被定位于番茄的第8号染色体上。通过分析大豆的杂交后代，确定了大豆种子滞绿的4个突变位点D1、D2、G和cytG，其中：隐性遗传基因D1和D2双基因突变会导致种子滞绿；D1和G连锁突变则会引起种皮滞绿；cytG是细胞质遗传基因位点，该基因位点突变会使大豆衰老叶片的叶绿素含量稳定，不易转化为叶绿素a，阻碍叶绿素降解代谢的发生。

2 植物滞绿相关基因

SGR基因是叶绿素降解调控研究中的一个里程碑，在叶绿素降解的最初阶段表达，调节与衰老相关的色素降解。叶绿素降解早期反应过程主要是在由NYC/NOL和HCAR基因的产物催化下叶绿素b通过两步酶还原反应转化为叶绿素a，这些基因的突变会造成出现修饰性的滞绿。然而，在拟南芥中SGR、NYC1、PPH和ACD2等基因都是通过转录水平调控基因的表达。总之，SGR基因可通过调控叶绿素降解与合成相关基因在叶绿素合成和降解代谢途径中的表达，从而控制叶片滞绿表型。

目前，已在多种植物中鉴定得到NYE1的直系同源基因，如NYC1、CRN1、NYC3等基因在植物体内高度保守，当植物成熟和衰老时这些基因发生表达导致叶片或果实滞绿的表型特征，研究者们将这些基因统称为衰老诱导的叶绿体滞绿相关蛋白基因。自拟南芥基因组测序完成之后，人们通过快中子诱变突变体筛选得到一个滞绿突变体nye1-1，并通过图位克隆获得了一个叶绿素降解代谢的关键调控基因NYE1。从2006到2007年，至少5个独立的研究小组在不同物种中成功鉴定到NYE1的直系同源基因。通过基因渗入法，将bf993的y基因位点转移到黑麦草属物种中[26]，利用图位克隆技术，y基因位点首先被粗定到5号染色体中一个10 cM遗传距离区域。通过对TIGR数据库检索发现，该遗传区域包含30个基因，其中一个基因Os09g36200和拟南芥衰老相关基因At4g22920高度同源。分析2个不同的水稻sgr突变体和拟南芥nye1-1突变体后发现，造成这些突变体滞绿表型的是同一个基因。随后的研究发现，有更多滞绿突变体的遗传缺失都是由这个滞绿基因（NYE1/SGR）失活造成的。

滞绿基因主要来源于非功能滞绿突变体，作为叶绿素分解的启动因素，主要调控PsⅡ捕光-叶绿素（LHCⅡ-Chl）复合体的拆卸。滞绿基因如果缺失会造成在衰老过程中叶绿素降解受到抑制，但是叶绿体类囊体膜和叶绿素蛋白复合体结构保持完整，光合能力也随之下降。目前，关于SGR基因调控叶绿素降解的作用机制研究仍处于起步阶段。对于衰老叶片和成熟种子或果实中叶绿素的降解，有研究认为，SGR1/NYE1可以与光捕获复合物Ⅱ （LHCⅡ）结合，制约了sgr突变体中叶绿素和LHC蛋白的降解。此外，SGR1/NYE1蛋白也可与叶绿素降解关键酶CCEs形成互作关系。对于种子成熟过程中的叶绿素降解，最新研究发现，ABI3通过与SGR1/NYE1和SGR2/NYE2的启动子结合正向调控基因表达，从而促进种子成熟过程中叶绿素的降解[27-28]。

SGR基因家族中的突变已经被指定为C型滞绿突变体，其缺乏叶绿素分解能力，但具有其他正常的衰老模式。C型滞绿突变体的一个特征是光捕获叶绿素结合蛋白（LHCP）在叶和果实中持续，而其他衰老过程如正常一样继续，这表明色素蛋白复合物的去稳定化是叶绿素降解所必需的。水稻SGR已被证明在体内和体外结合LHCPⅡ蛋白，这表明它可能会使色素-蛋白相互作用不稳定，因而允许蛋白酶和分解代谢酶的作用分别降解LHCP和叶绿素。在SGR中，单个氨基酸取代的可用性将有助于更详细地研究该蛋白的结构功能。导致强表型效应的4个氨基酸的取代现已在水稻、番茄和辣椒中的SGR直系同源物中鉴定。这些取代中，3个发生在跨物种边界的所有SGR家族成员内不变的氨基酸残基中，第4个SGR V99M发生在以大约相等的频率表征Val或Ile的残基处。水稻SGR中的V99M替代不破坏与LHCPⅡ的结合，表明该氨基酸对于SGR功能的一些其他方面可能是重要的，例如未知的催化活性或三级结构[29]。在水稻和拟南芥中，SGR的过表达产生了具有苍白表型的叶或组织培养转移后死亡的植物。拟南芥NYE1（At4g22920）的低水平过表达导致正常植物表型，而高水平表达导致叶片黄化，表明NYE1/SGR表达水平与叶绿素损失之间存在直接相关性。SGR基因在其他高等绿色植物中也相继被克隆出来，研究表明：SGR基因由核基因编码，翻译261～269个氨基酸；SGR蛋白都包含一个高度保守的C末端结构域（C-X3-C-X-C2-F-P-X5-P），这段保守结构域被从SGR蛋白高度保守的核心区分隔开，位于相似性较低的区域[30]；在N-端通常含有一个叶绿体的信号肽，其常在衰老诱导条件下完成特异表达，但它们如何发挥功能调控叶绿素的降解，目前还不清楚。

3 SGR的功能

历史上，SGR的缺陷与减少的PAO活性或表达相关。被归因于SGR的许多滞绿突变体表现出低水平的PAO活性，而其他分解代谢酶（特别是叶绿素酶和RCCR）的活性不受影响。PAO最近的分子克隆和PAO抗体的可用性允许详细分析滞绿突变体中PAO表达和蛋白质丰度。PAO活性的差异与用于测定的提取物中的PAO丰度相关，表明突变体和野生型之间的差异是仅由PAO的不均等效提取引起的假象。

SGR突变体的共同特征是在衰老过程中保留光合器官的叶绿素结合蛋白。特别地，LHCⅡ亚基在迄今为止分析的所有SGR缺陷型突变体中高度稳定。历史上，这已经通过与同时保留的叶绿素的连接来解释，即认为有缺陷的叶绿素降解在SGR突变体中被认为是叶绿素结合蛋白降解的前提条件。bf993显示累积了一个没有其N末端基质区域的LHCⅡ亚基的特定蛋白水解片段。这进一步指出了对LHC蛋白完全降解的叶绿素降解要求。

但是，这种观点可能是错误的。如上所述，迄今分析的PAO和所有其他分解代谢酶在SGR突变体中不受影响。SGR蛋白的鉴定并不表示可能的功能，因为SGR不包含任何已知的结构域。此外，叶绿素分解代谢步骤的酶活性，如叶绿素酶去饱和[30-31]不能归因于SGRs。从叶绿素蛋白复合物中提取叶绿素并与载体蛋白结合被认为是适当的叶绿素和（可能）脱蛋白降解的要求。然而，与已知的叶绿素结合蛋白相比，水溶性叶绿素结合蛋白、SGR在体外不能结合叶绿素。因此，假设SGR根本不是酶，这是合理的。最近的共免疫沉淀试验表明，OsSGR能够在体内特异性结合LHCⅡ亚基，但不与LHCⅠ亚基或叶绿素结合的核心复合物亚基（如D1）相互作用。这种结合也发生在OsSGR的V99M突变中，表明突变不影响结合。有人提出突变可能影响（未知）酶活性或可能破坏其他调节因子的结合，需要对其他SGR点突变进行功能分析来证实这一点。

总之，SGRs可能是参与LHCⅡ拆解的蛋白质因子的候选者，SGR在衰老过程中不间断地使叶绿素保持在稳定的脱辅基蛋白内。在这方面，SGR表达将是叶绿素分解的先决条件，但不是分解代谢因子本身。在NYC1和NOL突变体中，还保留了叶绿素和叶绿素结合蛋白。因此，似乎可能的是，2个因子同样重要，以诱导叶绿素蛋白复合物的不稳定性。此外，在PAO突变体衰老过程中，AtSGR1的mRNA水平降低，表明存在反馈机制。这种调节机制可以被看作是安全控制，以确保叶绿素降解仅在叶绿素分解代谢过程中才会发生。因此，除了分解代谢酶活性或表达的调节之外，通过SGR调节载脂蛋白拆解可以被认为是启动叶绿素分解所需的主开关。

4 茄科植物滞绿机理及其作用

人们长期研究的茄科植物有马铃薯、辣椒、番茄、烟草等。其中，烟草和番茄作为茄科植物的模式植物被深入研究。番茄和辣椒的绿色果肉（gf）和叶绿素保留（cl）的突变分别是在成熟期间抑制其降解叶绿素的能力，叶绿素和类胡萝卜素累积导致产生成熟果实，在颜色上变为棕色。gf和cl的表达在果实成熟开始时被高度诱导，与叶绿素的下降相关。由于番茄红素的积累和缺乏叶绿素降解，果实和叶片变为棕色，加上叶绿素的保留，类囊体颗粒、LHCP、Rubisco小亚基和33 kD氧化转化蛋白质也在突变果实和叶片中继续存在（图1）。因此，gf被分类为番茄的C型滞绿突变体。随着对gf和cl基因的不断研究，已在水稻中发现gf基因的点突变，导致水稻的SGR番茄同系物中一个不变残基的氨基酸被取代。同样也发现，cl的突变也在SGR的辣椒同系物中有不变残基的氨基酸的取代。同时，在草甸羊茅、豌豆、水稻和拟南芥中也鉴定出C型突变体降低了叶绿体中的PAO活性和色素蛋白复合物的稳定性[31]。最新研究得出，这些基因可能编码新的叶绿体靶向蛋白，促进叶绿素在类囊体膜中色素蛋白复合物的不稳定性降解。gf和cl突变基因的分子基础研究为番茄和辣椒的商业育种提供了早期选择性状的重要依据。

5 展望

马铃薯是仅次于水稻、小麦、玉米的第四大粮食作物，全球种植面积约为1 870万～1 920万hm2，总产量为3.2亿～3.4亿t[32]。我国马铃薯种植面积与产量均居世界第一，且产量达到世界的20%左右[33]，提高单产是我国马铃薯育种的主要目标。马铃薯在育种过程中主要采用常规育种，而育种过程中主要是以抗病、抗旱为基础。在滞绿突变延长光合作用时间方面的深入研究为人们在马铃薯增产育种方面提供了新的思路和方向。由于不同作物存在相同的滞绿表型，但是基因型却不同，如同一滞绿性状可能受不同基因控制，同一基因功能缺损的程度不同也可能会造成不一样的滞绿类型[34]。因此，研究不同类型滞绿基因并进行克隆及功能性验证，明确其对于延缓作物衰老的作用及机理，降低叶绿素分解速率，延长光合作用时间，对提高作物产量有重要意义。

目前，育种学家通过杂交育种的标记研究发现，滞绿突变体在茎秆抗逆能力（抗病、抗干旱、抗倒伏等）方面具有很强的优势，可作为遗传改良的育种材料[35-36]。参与叶绿素降解过程的滞绿基因SGR/SGRL可 以 同 多 种 CCEs（NYC1、NYE、PPH、PAO、HCAR、RCCR）和LCHⅡ发生互作，形成SGR-CCE-LHCⅡ大分子复合物，该大分子复合物可以降低叶绿素降解产物pFCC对细胞的毒害作用[28]。伴随着现代分子育种学的深入研究发现，SGR/SGRL基因普遍存在于高等植物中。但是，SGR/SGRL基因启动子顺式作用元件及其调控活性的研究报道还很少，与SGR/SGRL基因互作的关键转录因子能否引起植物滞绿表型等诸多问题尚待解开。

目前，对于青海省主导品种青薯9号的深入研究发现，该品种生育期较长，在生长后期一直保持绿色状态。因此，笔者以该品种为研究对象，克隆该品种的SGR基因，发现该基因的开放阅读框819 bp，编码272个氨基酸。序列比对分析发现，其包含了SGR的典型结构域；系统进化树分析显示，其与拟南芥、番茄和辣椒等SGR基因具有较高的同源性。对马铃薯SGR基因功能进行深入研究，可为其在马铃薯生产实践中提供更广阔的应用前景。