干巴菌菌种培养基碳源和氮源筛选

李方桥 谭爱华* 喻 敏 何成忠 望宏端

（1湖北三峡职业技术学院，湖北宜昌 443000；2宜昌山野味农产品专业合作社，湖北宜昌 443100）

干巴菌（Thelephora ganbajun Zang）又名干巴革菌[1]，隶属于担子菌门（Basidiomycota）革菌目（Thelephorales）革菌科（Thelephoraceae）革菌属（Thelephora），是一类风味独特的高等可食用真菌[2]。干巴菌主要分布在滇中高原，主产地为云南昆明、玉溪、曲靖、楚雄，其次为云南思茅、丽江、保山、大理，贵州西部、四川南部[3]、福建武夷山及湖北西部的局部地区也有少量分布，多生长于海拔600～2 500 m的松林地带[4]。湖北省干巴菌主要分布在宜昌市夷陵区和兴山水月寺境内。

干巴菌是野生食用菌中的上品。其菌香浓郁、生尝微甘，似有海藻气味，肉质坚韧，有腌牛肉干（民间俗称“干巴”）的浓郁香味，因而得名干巴菌。干巴菌含有钙、铁、蛋白质、维生素B1等多种营养物质及抗氧化物质，具有清除人体内自由基、延缓衰老、强身健体等功效[4]，是一种极具开发潜力的珍稀食用菌。干巴菌属于外生菌根食用菌，目前尚未人工栽培成功，市场上的干巴菌均来自野生[5]。由于具有生长环境独特、经济和食用价值较高以及难以人工栽培等特点，其自然资源极其有限。本研究主要针对采集于我国湖北省宜昌市夷陵区的野生干巴菌菌株，通过利用不同碳源、氮源配方的培养基进行培养，观察干巴菌菌丝生长情况，开展菌种培养基碳源、氮源筛选试验，以期为后期根据野生干巴菌生物学特性择点进行仿野生人工栽培研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018年7月，课题组在湖北省宜昌市夷陵区下堡坪乡麦子山村采集干巴菌子实体，在湖北三峡职业技术学院食用菌实验室进行菌种分离、纯化培养并保存，编号Tg2018-1。

1.2 试验地点

本试验母种培养基筛选试验在湖北三峡职业技术学院食用菌实验室进行，栽培种培养基筛选试验在宜昌山野味农产品专业合作社的菌种厂进行。

1.3 试验方法

1.3.1 母种培养基碳源、氮源的筛选。首先制备松针水，即称取松针200 g，加入1 000 mL蒸馏水，煮沸30 min后用4层纱布过滤，取上清液备用。

母种培养基主要碳源分别为马铃薯、糙米、红薯、芋头，均去皮切碎。每种碳源各称取200 g，分别加1 000 mL松针水煮沸20 min至熟而不烂，4层纱布过滤取汁，然后各加葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、磷酸二氢钾 2 g、硫酸镁 0.5 g、硫酸亚铁 0.5 g、琼脂15 g，待琼脂完全融化后，分别补松针水至1 000 mL，混匀，pH值自然。同时，以马铃薯为主要碳源，其他成分同上，所有用水改松针水为蒸馏水作为对照组（CK1）。

母种培养基主要氮源分别为蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、蛋白胨和酵母粉1∶1的混合物。每种氮源各取2 g，分别添加马铃薯（去皮）200 g，加1 000 mL松针水煮沸20 min至熟而不烂，4层纱布过滤取汁，然后各加葡萄糖20 g、磷酸二氢钾2 g、硫酸镁0.5 g、硫酸亚铁0.5 g、琼脂15 g，待琼脂完全融化后，分别补松针水至1 000 mL，混匀，pH值自然。同时，以蛋白胨为主要氮源，其他成分同上，所有用水改松针水为蒸馏水作为对照组（CK2）。

以上培养基配好后，用20 mm×200 mm试管常规分装，121℃高压灭菌40 min，制作成试管斜面培养基；无菌操作接入干巴菌菌种后，置于25℃恒温箱培养。培养期间，观察记载干巴菌母种在不同碳源试管培养基和不同氮源试管培养基中菌丝生长速度、生长势等情况。每种培养基接种10支试管。

1.3.2 栽培种培养基碳源、氮源的筛选。碳源筛选试验设计了5个处理，分别为4个加40%松针、添加不同碳源的处理和1个不加松针、以棉籽壳为碳源的对照组（CK3），具体培养基配方见表1。氮源筛选试验设计了5个处理，分别为4个加40%松针、添加不同氮源的处理和1个40%棉籽壳代替松针、以麸皮为主要氮源的对照组（CK4），具体见表2。

表1 干巴菌栽培种不同碳源培养基配方

表2 干巴菌栽培种不同氮源培养基配方

制作栽培种培养基时，各配方中麦粒或者玉米芯、棉籽壳、糯米均提前一天按照配方称量，用水浸泡24 h后捞出沥干水分，再加入其他主料、辅料，充分拌匀，调节pH值和含水量；装入规格为15 cm×28 cm×40 μm 的耐 126℃高温、符合 GB 9688—1988卫生规定的聚丙烯塑料袋内，每袋装干料0.30 kg；用LDZF-75KB型立式压力蒸汽灭菌器121℃高压灭菌2 h，冷却到28℃以下后无菌接种。每个处理接种10袋，置于25℃左右的恒温培养室内避光培养，相对湿度65%～70%。

1.4 观察内容与测定方法

连续培养3 d后，在干巴菌菌落边缘，用记号笔在试管或菌袋上画起始线。长到试管或者菌袋1/2之前每2 d观察记录一次，1/2之后每天观察记录一次，观察记录各培养基中干巴菌菌丝体的生长状态。待母种菌丝充满试管、栽培种菌丝充满菌袋后，再用记号笔画终点线，用游标卡尺测量起止点间菌丝体长度，计算菌丝体的平均生长速度和满管（袋）天数，并进行差异显著性分析。试验获得的数据采用Excel 2010和SPSS 25.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 母种培养基中干巴菌菌丝的生长情况

2.1.1 不同碳源培养基中母种菌丝生长情况。母种在不同碳源培养基中菌丝生长情况见表3。由表3可知，干巴菌菌丝在不同碳源培养基上的生长速度不同，由快到慢依次为马铃薯（4.530 mm/d）、红薯（4.190 mm/d）、芋头（3.450 mm/d）、糙米（3.280 mm/d）、马铃薯对照组（2.850 mm/d）。所有用松针水的培养基中菌丝生长速度均快于用蒸馏水的对照组（CK1），而且差异显著。

表3 母种不同碳源培养基干巴菌菌丝生长情况

在加松针水的4个配方中，以马铃薯为碳源与以红薯为碳源的培养基中菌丝生长速度差异不显著，但均与分别以糙米、芋头为碳源的培养基中菌丝生长速度差异显著。表明干巴菌在分别以马铃薯、红薯为碳源的培养基中生长速度较快，马铃薯和红薯是干巴菌母种制备中碳源的首选。从菌落形态看，各处理菌落均为圆形，但干巴菌菌丝在分别以马铃薯、糙米为碳源的培养基中菌落边缘均整齐，在分别以红薯、芋头为碳源的培养基中边缘均不太整齐。从菌丝长势和菌丝密度看，干巴菌菌丝在不同碳源培养基上的长势从强到弱依次为马铃薯、红薯、芋头、糙米，与生长速度次序一致；在分别以马铃薯、糙米和红薯为碳源的培养基中菌丝均比较粗壮、浓密，在以芋头为碳源的培养基中菌丝较细、密度小一些，同时在分别以红薯和芋头为碳源的培养基中菌丝密度不太均匀。从菌丝颜色看，在4种培养基中，干巴菌菌丝均为白色，外缘较淡。综合来看，干巴菌母种培养基以马铃薯作碳源较好，配制培养基用松针水效果明显。

2.1.2 不同氮源培养基中母种菌丝生长情况。母种在不同氮源培养基中菌丝生长情况见表4。由表4可知，干巴菌菌丝在不同氮源培养基上的生长速度不同，由快到慢依次为50%蛋白胨+50%酵母粉（5.060 mm/d）、蛋白胨（4.820 mm/d）、酵母粉（3.840 mm/d）、牛肉膏（3.580 mm/d）、蛋白胨对照组（3.140 mm/d）。 所有用松针水的培养基中菌丝生长速度均快于用蒸馏水的对照组（CK2），而且差异显著。在加松针水的4个配方中，以50%蛋白胨+50%酵母粉为氮源与以蛋白胨为氮源的培养基中菌丝生长差异不显著，但均与分别以牛肉膏、酵母粉为氮源的培养基差异显著。从菌落形态看，各处理菌落均为圆形，除以牛肉膏为氮源的培养基中菌落边缘不太整齐外，其他培养基中菌落边缘均整齐。从菌丝长势和菌丝密度看，也只有以牛肉膏为氮源的培养基中菌丝长势弱、不够浓密、不太均匀。从菌丝颜色看，各培养基中没有明显差别。综合来看，干巴菌母种培养基以50%蛋白胨+50%酵母粉作氮源较好，配制培养基用松针水效果明显。

表4 母种不同氮源培养基干巴菌菌丝生长情况

2.2 栽培种培养基中干巴菌菌丝的生长情况

2.2.1 不同碳源培养基中栽培种菌丝生长情况。栽培种在不同碳源培养基中菌丝生长情况见表5。由表5可知，干巴菌菌丝在不同处理培养基中菌丝满袋时间由快到慢依次为处理 4（39 d）、处理 1（47 d）、处理 3（48 d）、处理 2（50 d）、CK3（56 d），菌丝生长速度由快到慢的次序与满袋时间一致，所有添加松针的培养基（处理 1、2、3、4）中菌丝生长速度均明显快于不添加松针的对照组（CK3），而且差异显著。在4个添加松针的供试培养基中，处理4与处理1、2、3相比，满袋时间及菌丝生长速度均存在显著性差异。从菌丝长势、菌丝密度看，处理4明显优于处理1、2、3及CK3。从菌丝颜色看，各处理相差不大，均为白色。综合来看，以处理4效果最好，即干巴菌栽培种培养基以糯米作主要碳源，而且添加40%的松针。

表5 栽培种不同碳源培养基干巴菌菌丝生长情况

2.2.2 不同氮源培养基中栽培种菌丝生长情况。栽培种在不同氮源培养基中菌丝生长情况见表6。由表6可知，干巴菌菌丝在不同处理培养基中菌丝满袋时间由快到慢依次为处理D（40 d）、处理A（47 d）、处理 B（49 d）、处理 C（55 d）、CK4（60 d），菌丝生长速度由快到慢的次序与满袋时间一致，所有添加松针的培养基（处理A、B、C、D）中菌丝生长速度均明显快于不添加松针的对照组（CK4），而且差异显著。在4个添加松针的供试培养基中，处理D与处理A、B、C相比，满袋时间及菌丝生长速度均存在显著性差异。从菌丝长势、菌丝密度看，处理D明显优于处理A、B、C。从菌丝颜色看，各处理相差不大，均为白色。综合来看，以处理D效果最好，即干巴菌栽培种培养基以麸皮作主要氮源，而且添加40%的松针。

表6 栽培种不同氮源培养基干巴菌菌丝生长情况

3 结论与讨论

本试验结果表明，不同碳源、氮源的培养基对干巴菌菌丝生长的影响较大。干巴菌的母种培养基用松针水配制，栽培种培养基中添加40%的松针，其菌丝生长速度、长势、密度均优于对照组。综合菌丝生长速度、菌丝长势、菌丝密度来看，干巴菌母种培养基最适合的主要碳源是马铃薯，最适合的主要氮源是蛋白胨与酵母粉1∶1的混合物；干巴菌栽培种培养基最适合的主要碳源是糯米，最适合的主要氮源是麸皮。本试验中其他条件和因素均采用常规食用菌菌种培养配方和条件，针对干巴菌各级菌种生产的最佳配方和条件还需进一步研究。

外生菌根真菌需要与其宿主植物共生才能完成生长发育，如果要得到干巴菌子实体，必然要先合成菌根或进行人工促繁，而培养优良外生菌根真菌菌种是建立菌根化技术的重要前提[6]。本课题组目前已培养得到大量干巴菌栽培种，使下一步的仿野生栽培干巴菌成为可能。