抗氧化剂对高压加工处理后猪肉中蛋白质及脂质氧化的影响

曹新桥

河南双汇投资发展股份有限公司技术中心 河南漯河 462000

21世纪消费者寻求食用更加安全放心的肉类产品，通过高压处理的肉类产品，因其不添加食品防腐剂、保持其新嫩口感，而受到消费者的青睐。然而通过高压加工会影响肉制品的部分感官特性，处理后肉制品其理化性质改变的同时，影响着其氧化程度及质地的改变[1]。高压处理肉制品的研究旨在最大限度地发挥高压处理的优势，同时降低压力处理对猪肉感官特性的影响[3]，相关研究表明，低温储存肉制品中的脂质氧化尤为严重[1]。当高压处理(>300MPa)更加容易加速肉制品中脂质氧化，导致脂质氧化的初级和二级反应，并产生了大量的共轭二烯、氢过氧化物、羰基化合物、酮类、醇类和醛类等多类产物[2]。多项研究表明不同来源(牛肉、鸡肉、猪肉)的生肉和加工肉制品通过增加压强加深了脂质氧化的程度[3,4]。针对这一问题，添加抗氧化剂(乙二胺四乙酸(EDTA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、维生素E、鼠尾草和迷迭香提取物)被证明可有效提高肉制品的抗氧化能力，迷迭香提取物可以显著降低鸡肉产品中的脂质氧化程度，而迷迭香提取物可以延缓鸡肉和猪肉中脂质的氧化[5～7]。此外，抗坏血酸盐已在肉类加工中用作增色剂和抗氧化剂，研究表明，抗坏血酸、亚硝酸钠和氯化钠有助于提高压强处理后牛肉制品颜色的稳定性[7]。然而，消费者越来越倾向于使用迷迭香提取物等天然添加剂。

处理过的肉制品中蛋白质氧化，严重影响肉制品的感官特性。蛋白质羰基化伴随着必需氨基酸的损失和蛋白质消化率的降低，从而影响肉制品的营养价值[8]。在对碎牛肉、盐水注射猪肉和干腌火腿进行压力处理(600MPa)后，蛋白质羰基化增加30%[9]。脂质和蛋白质氧化的机制虽然不同但密切相关，两个过程可能受到类似的促氧化剂和抗氧化因子的影响[10]。然而，加压肉制品中这些氧化现象之间的相互作用机理尚不完全清楚。本研究目的在于测定抗氧化剂对高压处理猪肉中脂质、蛋白质氧化、颜色变化及亲水和亲脂化合物的抗氧化活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉肌肉，采购于河南双汇投资发展股份有限公司。

抗坏血酸钠、鼠尾草酸、鼠尾草酚、氯化钠、氯化镁、磷酸二氢钠、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、盐酸、磷酸缓冲液、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、丙二醛、尿素、柠檬酸、抗坏血酸、乙醇，均采购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

数字温度表，TESTO-622，深圳市汇驰恒达科技有限公司；

水分活度仪，HD-4，华科仪器有限公司；

通用色差计，JZ-300，上海爱色丽色彩科技有限公司；

离心机，3C-3614，上海迪图生命科技有限公司；

电子分析天平，AX224ZH/E，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；

绞肉机，JYC12，宁波皓鹰食品机械有限公司；

质构分析仪，TA.TOUCH，青岛金诺机械有限公司；

紫外分光光度计，UV-754，上海精科分析仪器厂；

冷冻离心，GL-20G-II，上海瑞沃德生命科技有限公司；

气动液压增压系统，上海帕格液压设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

取样自3d内屠宰排酸后猪肉肌肉，pH值为5.51±0.05。将猪肉切碎约5.5mm碎块并与猪肉肥膘混合(比例为30g/100g)。

1.3.2 压力处理

增压速率3MPa/s(500MPa)处理6min，立即2s内迅速减压，容器内的温度为20±3℃。

1.3.3 颜色测定

猪肉样品自自封袋取出后，立即使用分光光度计测定猪肉表面颜色，颜色以L*、a*、b*值(亮度L*、红度a*和黄色b*)。

1.3.4 脂质氧化

使用均质机在冰浴中将猪肉打碎为匀浆，在4 000g下离心10min(4℃)。通过滤纸过滤上清液。将滤液与含有0.3%硫代巴比妥酸、10%三氯乙酸的溶液混合均匀，100℃水浴加热30min，随后立即冰浴。检测400nm到600nm样品吸光度。结果以每公斤肉样中丙二醛(MDA)含量表示。使用丙二醛二甲缩醛从标准曲线中计算MDA浓度，每组实验的四个样品。

1.3.5 蛋白质氧化

1.3.5.1 羰基含量

根据Oliver C. N[11](1987)方法评估蛋白质羰基化合物，样品置于4℃冰箱，通过纱布过滤匀浆，取100μL滤液用1mL，10%三氯乙酸进行沉淀。将800μL 0.2%的二硝基苯肼溶液添加到沉淀中，对照组为2M HCl溶液，混合溶液室温下搅拌孵育1h，加入1mL 10%三氯乙酸后得到沉淀，用1mL乙醇-乙酸乙酯(1∶1)溶液使用移液枪充反复吹洗3次，得到沉淀放置于离心管中，4℃通风橱干燥，将所得沉淀溶解在1mL 6M盐酸胍中。置于离心机中(10 000g，4℃，5min)去除沉淀。将溶液放于(250～500nm),空白对照为HCl溶液校正。使用DNPH在370nm处的消光系数计算蛋白质羰基化合物浓度，并使用280nm处的吸光度从相同样品中获得蛋白质浓度，以每克蛋白质固定的DNPH微摩尔数表示。

1.3.5.2 硫醇基含量

依照Ellman G L[12](1958)方法测定，将上述滤液(250μL)与2.5mL含有8M尿素的磷酸盐缓冲液混合，加入50μL 10mM 5,5'-二硫代-双2-硝基苯甲酸。15min后测量412nm处的吸光度。使用l-半胱氨酸从标准曲线估算硫醇基含量。使用双缩脲测定法测定样品的蛋白质浓度，每组实验4个样品。

1.4 统计与分析

实验数据收集后使用Excel 2019记录。SPSS 19.3对实验结果进行单因素方差分析，采用Duncan多重比较方法进行显著性分析，通过方差分析评估因素(压力、配方和储存时间)之间的主要影响和相互作用。Tukey检验(置信水平为95%)用于确定均值之间的显着差异。

2 结果与分析

2.1 颜色变化

肉制品的氧化影响感官质量在消费者的选择购买中起着重要作用，在压强处理、迷迭香提取物和抗坏血酸钠对肉样颜色改变的试验中(如表1)表明。

表1 猪肉冷藏过程中亮度(L*)，黄色(b*)，红色(a*)Table 1 Lightness (L*), yellowness (b*) and redness (a*) of pork duringrefrigerated storage

未经处理的猪肉亮度值(L*)不受抗坏血酸钠或迷迭香提取物的影响。与之相反的是高压处理增加了肉样亮度值，经过低温储存后其亮度值没有发生改变。含有抗坏血酸钠或迷迭香提取物的未处理样品红度值(a*)高于未处理的对照样品，且不受冷藏储存的影响。相比之下，肉样红度值在压强处理后立即下降，并在储存过程中进一步下降，抗坏血酸钠或迷迭香提取物不会影响样品的红度值(a*)。未经处理的猪肉的黄度值(b*)随冷藏储存而降低，与未经处理的样品相比，样品在高压处理后黄度值下降。然而，处理过的肉样的黄度值在储存过程中有所增强，而抗坏血酸钠或迷迭香提取物，并没有改善未经处理或处理过的样品的黄度值的稳定性。添加抗坏血酸钠或迷迭香提取物，只会增强未经处理的猪肉的红度值，可能是通过减少氧合肌红蛋白的氧化来进行的。

2.2 脂质氧化

高压处理和抗氧化剂对脂质氧化的影响如图1所示。

图1 高压处理和添加剂猪肉冷藏过程中硫代巴比妥酸积累的影响Fig. 1 Effect ofhigh-pressure processing and additives on TBARS values during refrigerated storage of pork

未经处理且没有添加剂的肉样在第10天积累了更多的次级脂质氧化物。未经处理肉样但添加抗坏血酸钠或迷迭香提取物在低温储存期间脂质氧化产物的积累量降低，高压处理后，猪肉中的脂质氧化物并没有立即产生而是随着储存时间氧化物越来越多。处理后样品在第5天与未处理样品在第10天所产生次级脂质氧化产物的浓度相似，在第10天观察到处理过的肉样中脂质氧化浓度最高。抗坏血酸钠或迷迭香提取物处理的肉样，在冷藏储存期间没有发生脂质氧化。迷迭香提取物具有阻止猪肉中的脂质氧化的功能，天然提取物的作用与同浓度的抗坏血酸钠，虽然具有不同的作用机制，但两者在肉制品中的功能相似。迷迭香提取物的活性成分主要为鼠尾草酚和鼠尾草酸为脂溶性，均为过氧自由基清除剂，通过氢原子供给给自由基中间体来发挥其作用[13]，而抗坏血酸钠则是水溶性的，可作为除氧剂、金属螯合剂和还原剂来抑制脂质的氧化。

2.3 蛋白质氧化

肉样中通过测量蛋白质羰基化和肉蛋白中硫醇基含量判定蛋白质氧化程度，高压处理和添加剂对蛋白质羰基化合物含量的影响如图2、图3所示。

图2 高压处理和添加剂对猪肉冷藏过程中蛋白质羰基化含量的影响Fig. 2 Effect of high-pressure processing and additives on protein carbonyls content during refrigerated storage of pork.

图3 高压处理和添加剂对猪肉冷藏过程中蛋白质巯基含量的影响Fig. 3 Effect of high-pressure processing and additives on protein thiol groups during refrigeratedstorage of pork.

不含添加剂肉样储存至第10天，蛋白质羰基化程度最高。添加抗坏血酸钠猪肉储存期间蛋白质羰基化略有增加，但与第0天相比没有显著性差异，含有迷迭香酸提取的样品在第10天蛋白质氧化物积累程度最高。样品在经过高压处理后蛋白质立即出现了羰基化，在随后的冷藏保存期间，其羰基化没有发生增加。在本实验中处理后样品与未处理样品低温储存第10天后，其羰基化程度相似，表明添加抗坏血酸钠或迷迭香酸提取物不能有效改变蛋白质的羰基化。

未经处理样品在储存过程中，如图3所示添加抗坏血酸钠会防止蛋白质的羰基化，而添加了迷迭香提取物不能有效防止蛋白质羰基化。冷藏期间含有迷迭香提取物未处理样品，及含有迷迭香提取物或抗坏血酸钠的处理样品中，观察到硫醇基团的降低。尽管抗坏血酸钠和迷迭香提取物，可有效防止处理样品后中的脂质氧化，但这些添加剂在冷藏期间并未抑制处理后样品中蛋白质氧化。相关研究表明，在压力处理(300MPa)后，迷迭香提取物使鱼糜中的蛋白质羰基化增加[14]。在肉制品中，蛋白质的氧化会导致肉质口感降低和营养价值的流失，需要更多的研究来确定何种天然提取物，可以防止压力处理猪肉的蛋白质及脂质的氧化。

3 结论

本实验中，高压处理(500MPa)会导致猪肉的颜色变化，主要包括亮度值(L*)不变、红度值(a*)及黄度值(b*)分别下降31.4%及26.8%，脂质氧化程度增加40.8%，样品中蛋白质羰基化增加46.7%及硫醇基损失约35.9%。抗坏血酸及其盐类、迷迭香提取物作为还原剂，有效降低了经高压处理后肉制品中的脂质氧化分别下降10.7%、44.7%。两种抗氧化剂分别提高了压力处理后猪肉的亮度值(L*)13.4%、13.6%。然而抗坏血酸钠或迷迭香提取物，不能有效防止高压引起的蛋白质氧化。本研究举例说明了在高压处理的肉类产品中，使用天然抗氧化剂(迷迭香提取物)来替代抗坏血酸钠的可能性。