驼源莠去津多克隆抗体的制备及间接竞争酶联免疫吸附分析方法的建立

齐 萌,周 惠,霍静倩,张金林

（河北农业大学 植物保护学院，河北 保定 071001）

莠去津属于三氮苯类除草剂，自被开发以来逐渐成为全球范围内使用量最大的旱田除草剂之一［1-2］。莠去津在开发和使用过程中是被认为是低毒的除草剂，但是随着莠去津的连续长期的使用，莠去津的一些环境毒性问题慢慢显露出来，目前在许多国家的环境样品中均可检测出不同浓度的莠去津或其代谢物的残留［3-5］。虽然距离欧盟禁止使用莠去津类产品已经过去了近20 年，但是仍可从环境中检测到莠去津［6］。长期接触莠去津会损害人的身体健康并对生态环境产生一些风险。欧盟早在2004 年限制其登记使用，但在2014 年德国西部地下水监测报告中发现，在1991 年最后1 次使用莠去津的地区，距地表30 m 深处土壤中检测到了莠去津［7］。对于水生生物来说，莠去津影响了其正常生长［8］，也会损害鱼类的肝脏代谢并产生遗传毒性损伤［9］，诱导鲤鱼嗜血淋巴细胞的凋亡［10-11］。也会影响人类激素的正常产生，造成激素紊乱［12］。有研究表明莠去津可使鹌鹑及植物受到影响［13-14］。同时，残留在土壤中的莠去津也会对一些非靶标敏感作物产生药害问题，已有研究证明残留的莠去津会对豆科等作物的生长产生影响［15］。

目前，针对莠去津的检测方法，比较常见的主要包括以大型仪器为主的仪器分析法和基于抗原-抗体反应的免疫分析方法［16-18］。在莠去津的残留分析中，仪器分析法方法的优势是十分明显的，检测灵敏，可以检测出环境中痕量的莠去津残留，但是仪器分析方法也有一定的局限性，例如使用仪器昂贵，检测成本高，前期投入较大，普适性较差，需要操作人员受过专业训练，同时需要对样品进行前处理，不适于现场检测。而免疫分析方法在这些方面具有优势，无需复杂的前处理，操作简单，更利于现场检测。已有学者使用免疫分析的方法来对莠去津进行检测。Sun 等［19］人开发了针对莠去津的单克隆抗体，在此基础上开发了检测莠去津的免疫层系试纸条，辅助手持装置可用于现场定量检测。Zumpano 等［20］人使用G 蛋白功能化磁性纳米粒子固定莠去津抗体，开发了检测莠去津的免疫传感器。李晓丽［21］等人开发了一种检出限为1.972 ng/mL 的针对莠去津的间接竞争免疫分析方法。Chio 等［22］人建立了一种使用荧光偏振免疫分析的方法检测莠去津，也达到了很好的检测效果，检测限为3 ng/mL。Wang 等［23］人开发了一种针对莠去津的单克隆抗体，并建立了dc-ELISA 和ICG 条带法检测丹参等中草药中的莠去津残留。

纵观已开发的针对莠去津的免疫分析方法，学者们多是基于兔源、羊源多克隆抗体和单克隆抗体［20,22,24］，并没有基于驼源的多克隆抗体。驼源多克隆抗体作为生产纳米抗体过程中的多克隆抗体，目前鲜有人探讨。通过深入研究驼源多克隆抗体，可以初步明确骆驼科动物的免疫效果，为后续纳米抗体的开发提供基础，同时由于骆驼科动物体型较大，可以产生大量多克隆抗体，利用该抗体开发的方法可以实现实验动物的最大利用，避免试验动物的浪费。

本研究利用开发纳米抗体过程中所产生的美洲驼血清开发了1 种基于多克隆抗体的莠去津酶联免疫分析方法，通过棋盘法确定了最佳包被抗原浓度和抗血清稀释倍及最佳反应体系；同时利用其他3种三氮苯类除草剂及常见环境代谢物进行多克隆抗体的特异性试验；通过测试环境中的实际样品，确定开发的方法对实际样品检测的适应性；开发的检测方法以期为后续纳米抗体的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

全波长多功能酶标仪（瑞士帝肯贸易有限公司）；Nanodrop（美国赛默飞世尔科技公司）；高速冷冻离心机（美国赛默飞世尔科技公司）；过氧化氢（美国西格玛奥德里奇贸易有限公司）；3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB，美国西格玛奥德里奇贸易有限公司）；莠去津及类似物及环境代谢产物标准品（美国西格玛奥德里奇贸易有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，美国西格玛奥德里奇贸易有限公司）；伴清蛋白（CON，美国西格玛奥德里奇贸易有限公司）；鸡卵白蛋白（OVA，美国西格玛奥德里奇贸易有限公司）；HRP 标记羊抗驼IgG（美国Jackson Immuno Research Labs 公司）；二甲基亚砜（EMD Millipore）；莠去津的巯基酸结合物、半抗原2h、半抗原2e 和半抗原4a（由美国加州大学戴维斯分校Hammock 实验室前期制备［25］）。

部分缓冲液配方如下：

10×PBS 缓冲液 ： 称取80 g NaCl、21.7 g Na2HPO4·7H2O、2 g KCl 和2 g KH2PO4，加入800 mL去离子水溶解，定容至1 L。1×PBS 缓冲液：将10×PBS 缓冲液按1∶10 的比例进行倍比稀释。1×PBST 缓冲液：在1 L 1×PBS 缓冲液中加入0.5 mL Tween-20，混匀备用。TMB 显色缓冲液（pH 3.8）：称取46.04 g 柠檬酸二氢钾水合物和0.10 g 山梨酸钾于1 L 去离子水中，充分搅拌溶解后室温储存备用。TMB 储备液：称取 375 mg TMB 溶解在30 mL 二甲亚砜（DMSO）中避光室温保存。显色液：分别取TMB 显色缓冲液11 mL，TMB 储备液200 μL 和1%过氧化氢溶液101 μL，充分混匀后现配现用。

1.2 美洲驼免疫及血清效价测定

1.2.1 美洲驼免疫试验 美洲驼为年龄1 岁6 个月的健康雄性美洲驼，免疫过程由美国Capralogics 公司完成。免疫前收集50 mL 血清作为阴性对照。半抗原2h 偶联伴清蛋白（CON）作为免疫原，初次免疫，免疫抗原用量为1 mg（以载体蛋白计算），与等体积的弗氏完全佐剂在注射器中充分乳化后进行皮下注射，加强免疫用量为0.5 mg （以载体蛋白计算）与等体积的弗氏不完全佐剂混合后注射。每3 周免疫1 次，免疫后1 周收集外周血，4 ℃放置2 h 后进行8 000 r/min，5 min 的离心，收集上清即为多克隆抗体。1.2.2 血清效价测定 以半抗原2 h（图1）偶联牛血清白蛋白（2h-BSA）作为包被抗原进行血清效价测定。取浓度为1 μg/mL 的2h-BSA 包被抗原溶液和BSA 溶液各100 μL 包被于96 孔板（Nunc MaxiSorp™），4 ℃孵育16 h；PSBT 洗板3 次并拍干后加入3%脱脂乳粉225 μL 进行室温封闭处理1 h；PSBT 洗板3 次并拍干后加入经1×PBS 缓冲液按1 000、3 000、9 000、27 000 倍稀释的多克隆抗体，室温孵育1 h；PSBT 洗板3 次并拍干后加入100 μL 的5 000 倍稀释的HRP 标记羊抗驼IgG 震荡孵育1 h；PSBT 洗板5 次并拍干后添加100 μL 显色液，避光震荡孵育15 min 后，加入100 μL 2 mol/L 硫酸终止反应并在450 nm 波长（Infinite M1000 Pro，瑞士帝肯贸易有限公司）下读取OD 值。

图1 半抗原2h（a）、2e（b）、4a（c）及莠去津（d）的分子结构式Fig.1 The molecular structure of hapten 2h, 2e, 4a and atrazine

1.3 基于驼源多克隆抗体的间接竞争酶联免疫分析方法的建立

1.3.1 莠去津间接竞争酶联免疫分析方法 间接竞争酶联免疫分析的操作步骤与效价测定步骤类似，区别在于完成封闭并洗板后，间接竞争酶联免疫分析方法要同时加入多克隆抗体和不同浓度的莠去津标准品各100 μL，其中莠去津标准品浓度为0、0.034 0、0.102、0.305、0.914、2.74、8.23、24.7、74.1、222、667 和2 000 ng/mL。

不含莠去津标准品孔的OD 值减去最大浓度标准品孔的OD 值值定义为B0，不含标准品孔的OD值减去其余各浓度标准品孔的OD 值定义为B，以B/B0 为纵坐标，莠去津标准品浓度的log 值为横坐标绘制标准曲线，根据回归方程将灵敏度定义为IC50（B/B0=50%）。

1.3.2 包被抗原的选择及抗原和抗体浓度的优化 采用棋盘法筛选包被抗原及抗体浓度，具体操作步骤与血清效价方法类似，区别在于进行包被步骤时分别包被不同浓度（0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、5.0、10 μg/mL） 的2h-BSA、2h-OVA、2e-BSA、2e-OVA 和4a-BSA、4a-OVA 于96 孔板中；封闭且洗板后加入不同的浓度多克隆抗体；最终读数后，选择OD 值为1.5～2.0 左右的包被抗原浓度及抗体浓度为工作浓度。

在确定工作浓度后，进行各组合的莠去津间接竞争酶联免疫分析方法测定，通过IC50确定最佳包被抗原和多克隆抗体组合。

1.3.3 工作溶液的优化

（1）离子强度的优化：在最佳包被抗原及多克隆抗体的条件下，在PBS 缓冲液的基础上，配制NaCl 浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mol/L 的PBS缓冲液用于稀释多克隆抗体和莠去津标准品，根据IC50确定最佳离子强度。

（2）不同pH 对分析方法的影响：分别配制pH为5.0、6.0、7.0、7.4、8.0 和9.0 的PBS 缓冲液用于稀释多克隆抗体和莠去津标准品，根据IC50确定最优pH。

（3）不同甲醇浓度对分析方法的影响：分别配制含有甲醇浓度为0、5%、10%、20%和40%的PBS 缓冲液用于稀释多克隆抗体和莠去津标准品，根据IC50确定最佳甲醇浓度。

1.4 莠去津多克隆抗体特异性的测定

在优化的分析体系下，使用开发的ic-ELISA分别对莠去津、西玛津、特丁津、特丁净、三聚氰酸、去异丙基莠去津、2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、三聚氰氨、2-羟基莠去津、莠去津的巯基酸结合物进行交叉反应试验。将以上物质按一定浓度配制成标准溶液，建立标准抑制曲线，并计算各自的IC50，按下式计算交叉反应：

交叉反应（CR%）=IC50（莠去津）/IC50（供试物）

1.5 样品添加回收实验

选择加州大学戴维斯分校校园河流水、萨克拉门托河和索拉诺湖中的水样进行样品添加回收试验。试验表明水样离心并过膜后基本无基质效应，由高效液相色谱确认水样中无莠去津［26］。分别在离心并过膜后的水样中添加不同浓度的莠去津溶液使其终浓度为1、10、50 ng/mL。使用开发的酶联免疫分析方法和高效液相色谱法对水样中的莠去津进行测试，其中测试委托加州大学戴维斯分校仪器中心进行。根据结果计算各样品中莠去津的浓度，并计算添加回收率。

2 结果与分析

2.1 莠去津抗血清效价测定

美洲驼免疫后，利用同源包被抗原2h-BSA 进行效价监测，结果如图2 所示，随着免疫次数的增加，抗血清效价逐渐增加，第5 次免疫后，效价提升缓慢，出于时间和经济成本，使用第6 次免疫后的多克隆抗体建立莠去津间接竞争酶联免疫分析方法。

图2 多克隆抗体效价Fig.2 The titer of polyclonal antibody

2.2 基于莠去津多克隆抗体的间接竞争酶联免疫分析方法的建立

2.2.1 最佳包被抗原及抗血清浓度 当包被抗原为2h-BSA 和2h-OVA 时的最佳包被抗原浓度为0.8 μg/mL，多克隆抗体稀释倍数为60 000 倍。当包被抗原为2e-BSA 和2e-OVA 时最佳包被抗原浓度为1 μg/mL，多克隆抗体稀释倍数为50 000 倍；由于2e 为异源包被抗原，其在三氮苯环的R2 位与免疫原有差异，但是差异并不大，因此抗体用量较高。当包被抗原为4a-BSA 和4a-OVA 时最佳包被抗原浓度为1 μg/mL，多克隆抗体稀释倍数为1 000 倍；由于4a 的化学结构与免疫原2 h 在载体蛋白偶联部位存在很大差异，因此抗体用量最高。在最佳工作浓度的基础上，分别测试了不同包被抗原条件下的IC50（图3），结果表明当包被抗原为2e-BSA 时灵敏度最高，IC50为15.10 ng/mL，因此后续方法基于2e-BSA 建立。

图3 不同包被抗原对灵敏度的影响Fig.3 Effects of different coating antigen on sensitivity

2.2.2 最佳工作溶液 离子强度的优化结果表明，随着NaCl 浓度的升高，灵敏度逐渐先升高后降低，当浓度超过0.6 mol/L 时抗体结合减弱，过低或过高的NaCl 浓度均不利于检测，因此最适的NaCl 浓度0.2 mol/L（图4-a）。不同pH 值的优化结果表明，过低或过高的pH 值使吸光度值发生了明显的下降，影响了抗体与抗原的结合力，当pH 值为7 和7.4时，灵敏度最好，但是考虑空白孔的吸光度值，选择pH7.4 为最适pH 值（图4-b）。甲醇浓度优化的结果表明，随着甲醇浓度的提高，吸光度和灵敏度均降低，说明过量的甲醇会对抗体的结合产生影响，而少量的甲醇有助于提高莠去津标准品在反应中的溶解度和稳定性［27］，当甲醇浓度为5%，灵敏度最好（图4-c）。

图4 工作溶液的优化Fig.4 Effects of different factors on sensitivity

2.2.3 基于美洲驼多克隆抗体的ic-ELISA 的灵敏性评价 在最佳条件下，绘制的标准抑制曲线如图5，IC50值为12.13 ng/mL，线性检测范围为5.982 ～32.48 ng/mL，最低检测限为0.051 6 ng/mL。

图5 莠去津ic-ELISA 标准抑制曲线Fig.5 Calibration curve of indirect ELISA for atrazine

2.3 莠去津多克隆抗体的特异性评价

使用开发的ic-ELISA 分别对莠去津和一些结构类似物及代谢产物进行了交叉反应试验。结果如表1 所示。由于莠去津与西玛津、特丁津和去异丙基莠去津的结构类似，因此交叉反应率较高，对特丁津的交叉反应率达到95.8%，对西玛津和去异丙基莠去津的交叉反应率也大于50%，对其他化合物交叉反应＜0.1%。这主要是由于免疫原的载体蛋白偶联在三嗪环的R3 位置，因此抗体识别区域在R1 和R2 位置，而莠去津与西玛津、特丁津和去异丙基莠去津的在R1 和R2 位置结构类似，因此产生了较高的交叉反应性。

表1 多克隆抗体与莠去津结构类似物的交叉反应试验Table 1 Cross-reactivity of the serum against triazines analytes and metabolites

续表：

2.4 样品添加回收实验

为了验证开发的方法对实际样品对检测情况，进行了样品的添加回收试验，从美国加州大学戴维斯分校附近选择3 处取样点，分别为加州大学戴维斯分校校园内河流、萨克拉门托河和索拉诺湖。根据预实验，经过离心后的水样基本无基质效应，因此将水样离心过膜后，分别在样品中添加不同浓度的莠去津溶液使其终浓度为1、10、50 ng/mL，直接进行检测。同时使用高效液相色谱对水样中的莠去津进行测试，测试委托加州大学戴维斯分校仪器中心进行。添加回收结果如表2 所示，添加回收率在90.1%～114.2%之间，变异系数在1.04%～4.66%之间，说明开发的莠去津ic-ELISA 方法可用于检测环境实际样品，也符合IUPAC 中对ELISA 评价的标准要求［28］。

表2 样品添加回收实验Table 2 Detection results of the recovery test

续表：

3 讨论与结论

抗体本质上是机体内由免疫系统产生的一种特殊的呈“Y”型形状的免疫球蛋白，用于识别和中和细菌和病毒等异物，抗体特异性识别的这些异物，被称为抗原。抗体又分为多克隆抗体、单克隆抗体和纳米抗体。多克隆抗体多来源于免疫后的动物血清；单克隆抗体在免疫动物基础上，进行细胞融合、选择性培养、杂交瘤细胞筛选等步骤，最后进行单克隆抗体的大量制备；而纳米抗体是骆驼科和鲨鱼科体内产生的独特天然缺失轻链的抗体，通过对骆驼科动物免疫，外周血中提取淋巴细胞利用分子生物学手段开发纳米抗体，但是骆驼科动物在产生重链抗体时，体内同样会产生大量的多克隆抗体，而目前针对此部分的研究较少。Feng Wang 等［29］人利用骆驼多克隆抗体开发了用于检测果汁中的萘甲酸霉菌毒素的检测方法，为后续纳米抗体开发的开发提供了经验和基础。

通过对比开发的美洲驼多克隆抗体与其他动物抗体在灵敏度的差异，本方法的灵敏度与其他学者开发的兔及绵羊的多克隆抗体的结果类似并低于某些学者的研究结果［30-32］，分析原因是由于骆驼科动物体型较大，产生免疫反应需要更多的抗原刺激同时体液基数大，因此抗体效价相对低，后续可通过多克隆抗体纯化确定抗体浓度后进一步确定此猜想。开发的多克隆抗体对西玛津、特丁津和去异丙基莠去津的交叉反应率较高，分析原因之一是这3 种化合物与莠去津的结构极为相似，此外，由于多克隆抗体是针对多个抗原决定簇的混合抗体，特异性差也是其主要缺点之一。本研究结果与其他学者开发的莠去津多克隆抗体的特异性结果相一致［24,33,34］，虽然在一定程度上限制了开发的免疫分析方法，但是结合施药历史并使用仪器分析方法对待测区域进行初步分析，可有效规避此补足，本研究进一步促进了具有优异性能的纳米抗体的发展。