大豆GmPP2C89基因在盐胁迫中的功能分析

张 斌

(湖南科技学院 化学与生物工程学院，湖南 永州 425199)

植物在生长过程中经常会受到一些不利的环境因素影响，如干旱、盐、极端温度等，这对农作物的产量和品质会产生巨大的威胁[1]。在植物遭受非生物胁迫时，其自身也会进行一系列的调控以响应和适应外界不利的环境[2]。因此，对植物进行耐逆性遗传改良的基础就是探究植物响应胁迫的分子机制。大豆是我国重要的粮油作物，为食品加工和动物饲料制造提供原料，但高盐和干旱严重影响大豆的正常生长，导致减产，而关于大豆响应盐胁迫的分子机制也有较多报道，如ABA信号途径、SOS信号途径、转录因子调控等[3]。

植物响应非生物胁迫的基因表达调控是一个非常复杂的过程，可以发生在转录、翻译和翻译后修饰等多个层面，其中转录调控最为重要[4]。在转录水平上，基因表达的调控主要通过启动子区的顺式作用元件控制[5]。启动子是基因转录起始密码子上游的DNA序列，包含与转录因子相互作用的顺式作用元件，是转录因子启动或抑制基因表达的重要元件[4]。顺式作用元件作为重要的分子开关，在植物生长发育的各个阶段和环境适应方面都发挥着重要的功能。植物启动子元件在非生物胁迫应答方面的功能也已有较多的报道。拟南芥bZIP转录因子AREB1、AREB2和ABF3通过结合DREB2A启动子中的ABRE元件，激活下游靶基因的表达，进而调控植物对渗透胁迫的响应[6]。Yao等[4]研究发现，杨树ERF76基因启动子区含有多种非生物胁迫响应元件，如MYB、MYC和GT-1元件；并且在转基因拟南芥中ERF76启动子能够受盐胁迫诱导增强GUS报告基因的表达。满玲娟等[7]克隆了梭梭树HaFT-3基因启动子，通过转基因拟南芥证明HaFT-3基因启动子受高温、低温、ABA、IAA诱导。古袁扬等[8]研究发现，番茄SlNAC1基因启动子上包含多种生物和非生物胁迫应答元件，并通过构建5′-缺失的SlNAC1启动子驱动的GUS基因表达载体鉴定到盐响应关键元件—GT1GMSCAM4元件。

已有研究指出，植物PP2C家族成员在植物盐、干旱等胁迫响应中发挥重要调控作用[9]。拟南芥AtPP2CG1则以 ABA 依赖性方式对植物耐盐性进行正调控[10]；小麦TaPP2C1过表达可增强转基因烟草的耐盐性[11]。Zhang等[12]研究表明，二穗短柄草BdPP2CA6在拟南芥中过表达导致其生长前期对ABA的超敏感，并通过ABA依赖途径增强拟南芥耐盐性。Singh 等[13]研究发现，水稻PP2C基因OsPP108受ABA、盐和干旱胁迫诱导表达上调，过表达OsPP108的拟南芥在种子萌发、根系生长和幼苗生长过程中对ABA高度敏感；但是过表达OsPP108拟南芥植株对盐、甘露醇和干旱胁迫具有更强的耐受性。前期笔者对大豆进行盐处理后的转录组测序，在差异基因中筛选到一个上调倍数较高的基因GmPP2C89，但是该基因是如何响应盐胁迫的，其在植物抵抗盐害过程中的功能和机制仍需进一步探究。

本研究利用生物信息学技术分析了其启动子区的顺式作用元件，克隆不同长度的GmPP2C89启动子片段融合GUS报告基因，在拟南芥中探究该启动子的盐、干旱和渗透胁迫诱导效应，同时对可能的关键元件进行分析；并利用转基因拟南芥对基因的耐盐功能进行深入解析，旨在为研究大豆和其他物种PP2C家族基因的功能提供参考，也为大豆耐逆性遗传育种提供重要的候选基因。

1 材料和方法

1.1 植物材料培养

本研究使用的植物材料包括栽培大豆(Glycinemax)和拟南芥(Col-0，Arabidopsisthaliana)。将植物材料种子直接播种于营养土和蛭石混合(1∶1)基质中，用自来水浇灌，在植物生长室培养，条件：长日照(16 h昼/8 h夜)，温度22～25 ℃，空气湿度60%～70%。

1.2 RNA提取和荧光定量PCR分析

用20% PEG、300 mmol/L甘露醇溶液分别处理生长10 d的大豆幼苗，分别在0，6，12，24 h取叶片提取总RNA。利用反转录试剂盒SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis SuperMix(ThermoFisher scientific)合成cDNA，使用荧光定量PCR仪(CFX96，Bio-Rad，美国)进行荧光定量PCR检测。利用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。大豆UBI3基因和拟南芥ACTIN基因作为内参，本研究所用引物如表1所示。

1.3 启动子顺式作用元件分析及GUS载体构建

根据大豆基因组数据库(https：//soykb.org/)中启动子参考序列设计引物，以大豆DNA为模板克隆启动子片段，并对其进行测序。将启动子序列提交到在线数据库PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行顺式作用元件预测，统计非生物胁迫相关的元件位置和数量。克隆截断的启动子序列，将全长和截断的启动子片段插入PBI101载体的GUS基因上游，构建GUS载体，引物如表1所示。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.4 拟南芥遗传转化

将野生型拟南芥种子均匀播种于营养土和蛭石混合(1∶1)基质中，在植物生长室培养28～35 d，利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥，收获T0种子后，用卡那霉素或草铵膦筛选，并进行PCR鉴定，最终获得转基因拟南芥材料。

1.5 GUS染色

将拟南芥幼苗浸没到GUS染色液(1.44 mL 1 mol/L Na2HPO4、1.06 mL 1 mol/L NaH2PO4、1 mL 100 mmol/L K4Fe(CN)6·3H2O、1 mL 100 mmol/L K3Fe(CN)6、500 μL 500 mmol/L EDTA、50 μL TritonX-100、20 mg X-Gluc，用去离子水定容至50 mL)，用真空泵抽真空约5 min，然后置于37 ℃，避光12 h。将GUS染液回收后，加入75%乙醇脱色(除去叶绿素)，然后拍照观察GUS染色情况。

1.6 转基因拟南芥耐盐性分析

克隆GmPP2C89的CDS序列，构建过表达载体35S∷GmPP2C89，利用农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥。拟南芥种子经75%酒精消毒后于MS培养基和含有100 mmol/L NaCl的MS培养基上，在生长室垂直放置培养7 d，统计根长。培养室条件：温度25 ℃，长日照(昼16 h/夜8 h)，50%～70%相对湿度。拟南芥材料在营养土中正常生长28 d后，用150 mmol/L NaCl水溶液处理10 d，利用Zang等[14]报道的方法测定MDA含量和电解质渗透率。此外，提取拟南芥叶片RNA，利用荧光定量PCR检测抗氧化酶基因(SOD、POD和CAT)和ABA途径关键基因(RD26、RD29A和RD29B)的表达水平。

2 结果与分析

2.1 GmPP2C89基因的非生物胁迫诱导表达模式

前期对正常生长和盐处理的栽培大豆进行了转录组测序，数据已上传NCBI数据库(登录号：PRJNA741583)。在转录组数据中筛选到一个上调倍数较高的基因GmPP2C89(NaCl处理组该基因的平均FPKM值较对照组约上调42倍)(图1-A)。本研究又用20% PEG和300 mmol/L 甘露醇溶液处理栽培大豆幼苗，利用GmPP2C89基因的表达模式。结果显示，PEG和甘露醇处理均导致GmPP2C89基因表达水平显著上调，PEG处理后12 h表达水平上调倍数最高(25倍)(图1-B)，甘露醇处理6 h表达水平上调倍数最高(28倍)(图1-C)。

A.盐处理的大豆转录组数据中GmPP2C89基因的FPKM值；B.20%PEG处理的大豆中GmPP2C89基因的表达水平； C.300 mmol/L甘露醇处理的大豆中GmPP2C89基因的表达水平。不同字母表示差异显著(P<0.05)。图5，6同。 A.FPKM value of GmPP2C89 gene in soybean transcriptome data treated with salt；B.Expression level of GmPP2C89 gene in soybean treated with 20% PEG； C.Expression level of GmPP2C89 gene in soybean treated with 300 mmol/L mannitol.；Different letters indicate significant differences(P<0.05).The same as Fig.5，6.

2.2 GmPP2C89基因启动子区的顺式作用元件预测

利用PlantCARE数据库对GmPP2C89基因转录起始密码子ATG上游的2 000 bp序列进行顺式作用元件分析，结果发现，该启动子区含有较多参与非生物胁迫响应的元件，包括ABRE、DRE、G-box、MBS、MYB、MYC和TC-rich repeats等元件。其中ABRE元件数量最多，共4个；MYC元件3个；G-box、MBS、MYB和TC-rich repeats元件各2个；DRE元件1个(图2)。

图2 GmPP2C89基因启动子区非生物胁迫响应元件的分布Fig.2 Distribution of abiotic stress response cis-elements in the promoter of GmPP2C89 gene

2.3 不同长度的GmPP2C89基因启动子克隆及GUS融合载体构建

在克隆出2 000 bp的启动子片段基础上，根据顺式作用元件的功能和分布区域，将启动子片段分成3个不同长度的缺失片段，即本研究共包含4个启动子片段：启动子全长片段(P1)、3个5′端缺失片段(P2、P3和P4)。相比全长启动子，P2片段缺失了MYB、MYC和ABRE元件各1个；P3片段缺失了MYB、MYC和ABRE元件各2个，DRE和TC-rich repeats元件各1个；而P4片段缺失了全部的非生物胁迫响应元件，仅保留了核心启动子区(图3-A)。以大豆DNA为模板，使用高保真DNA聚合酶克隆得到长度分别为2 000，1 370，980，240 bp的启动子片段(图3-B)。利用同源重组技术将启动子片段插入PBI101载体以构建重组载体，并进行酶切验证，证明GUS融合载体构建成功(图3-C)。

A.不同长度的启动子及顺式作用元件位置；B.启动子片段克隆电泳；C.载体构建成功酶切电泳。 A.Promoters of different lengths and cis-element positions；B.Promoter fragment cloning electrophoresis diagram； C.Vector construction successful digestion electrophoresis diagram.

2.4 转基因拟南芥的获得及GUS染色分析

通过浸花法将GUS融合载体转化野生型拟南芥。利用卡那霉素筛选初步获得抗性植株，并进一步进行PCR鉴定获得转基因植株(图4-A—D)，分别用P1∷GUS、P2∷GUS、P3∷GUS、P4∷GUS表示。GUS染色结果如图4-E所示，正常培养的拟南芥P1∷GUS、P2∷GUS、P3∷GUS和P4∷GUS叶片都有

A～D.不同长度的启动子融合GUS载体转化的拟南芥筛选和PCR鉴定；E.150 mmol/L NaCl、20%PEG和300 mmol/L甘露醇处理后的GUS染色。

较浅的蓝色，说明截断的启动子序列也能在正常条件下启动基因的表达。在NaCl处理后，P1∷GUS和P2∷GUS植株叶片的GUS染色明显变深，P3∷GUS叶片次之，P4∷GUS叶片GUS表达则未被盐处理诱导。PEG模拟干旱处理也导致P1∷GUS和P2∷GUS叶片的GUS染色变深，P3∷GUS和P4∷GUS叶片中GUS都未被诱导。甘露醇处理则表现出与盐处理类似的现象，但是GUS染色相对较浅。说明GmPP2C89基因启动子区的非生物胁迫响应元件在盐、干旱和渗透胁迫中发挥特定功能。

2.5 GmPP2C89基因过表达增强转基因拟南芥耐盐性

本研究获得了GmPP2C89基因过表达的转基因拟南芥GmPP2C89-OX。根长试验表明，在正常MS培养基上，WT和GmPP2C89-OX拟南芥根长无显著差异，而在含100 mmol/L NaCl的MS上GmPP2C89-OXX根长显著高于WT(图5-A、B)。对生长28 d的拟南芥植株进行盐处理，结果显示，WT和GmPP2C89-OX的生长都受到抑制，但GmPP2C89-OX的长势明显优于WT(图5-C)。测定正常和盐处理条件下拟南芥叶片中的MDA含量(以鲜质量计)和电解质渗透率，发现盐处理条件下拟南芥GmPP2C89-OX叶片MDA含量(以鲜质量计)和电解质渗透率显著低于WT(图4-D、E)，说明拟南芥GmPP2C89-OX在盐胁迫条件下受伤害较轻、其耐盐性增强。

2.6 GmPP2C89过表达植株中胁迫相关基因表达发生改变

为了探究GmPP2C89介导的信号途径，利用荧光定量PCR技术检测了参与胁迫响应的抗氧化酶基因(SOD、POD和CAT)和ABA途径关键基因(RD26、RD29A和RD29B)的表达水平，结果显示，盐处理后这些基因在WT和GmPP2C89-OX中都显著上调；其中SOD、POD和RD29B在GmPP2C89-OX中的表达水平显著高于WT；而CAT、RD26和RD29A在WT和GmPP2C89-OX间无显著差异(图6)。这些结果初步证实，GmPP2C89通过调控胁迫相关基因的表达，增强拟南芥对盐胁迫的适应能力。

A～B.MS培养基和含100 mmol/L NaCl的MS培养基上的根长表型和统计；C～E.28 d的拟南芥经150 mmol/L NaCl处理10 d的表型和MDA含量、电解质渗透率。 A—B.Root length phenotype and statistics on MS medium and MS medium with 100 mmol/L NaCl；C—E.Phenotype and MDA content， electrolytic leakage of Arabidopsis thaliana treated with 150 mmol/L NaCl for 10 d.

图6 拟南芥植株WT和GmPP2C89-OX中胁迫相关基因的表达模式Fig.6 Expression pattern of stress-related genes in WT and GmPP2C89-OX seedlings

3 讨论

转录调控是植物应对不利环境因素的重要机制，通常由转录因子控制胁迫相关基因的表达来缓解逆境对植物造成的伤害，而在这一过程中，基因启动子上的顺式作用元件(即转录因子的结合位点)发挥主要作用[15]。徐金龙等[16]指出，非生物胁迫相关基因(RD29A、RD29B、RD22、ERD1等)启动子区的E-box(G-box)、ABRE、DRE、MYB、MYC、GT-1、W-box等元件可以与特定的转录因子结合参与胁迫反应，此外，MBS、TC-rich repeats等元件也参与植物非生物胁迫应答。PlantCARE是植物顺式作用调控元件数据库[17]，该工具被广泛地应用在植物启动子区顺式作用元件的预测研究中[4，7，18]。本研究利用PlantCARE数据库分析了GmPP2C89基因启动子上的顺式作用元件，发现包含ABRE、DRE、G-box、MBS、MYB、MYC和TC-rich repeats等元件，说明GmPP2C89基因表达水平受盐、干旱和渗透胁迫诱导上调很可能是由某个或多个特定转录因子调控。

陈雨倩等[18]根据顺式作用元件的位置分别克隆了不同长度的麻疯树JcGAST1基因启动子片段，通过烟草叶片瞬时表达和GUS染色确定了启动子的核心区域。本研究根据GmPP2C89启动子上非生物胁迫相关顺式作用元件的分布区域，克隆了启动子全长片段和3个不同长度的5′缺失片段，构建了启动子融合GUS的报告载体。可稳定遗传的转基因拟南芥可能是进行启动子响应非生物胁迫特性研究更好的材料，任丽等[19]克隆了白桦BpTCP7基因启动子，并利用启动子融合GUS载体转化拟南芥，分析了该基因的时空表达特异性，并证明NaCl、PEG 胁迫诱导处理后BpTCP7基因表达量上调(以拟南芥GUS染色深浅代表)。因此，将启动子融合GUS载体转化野生型拟南芥，获得纯合后代进行GUS染色分析。GUS染色显示，全长启动子能够被这3种胁迫诱导驱动GUS报告基因的表达；而不包含任何非生物应答元件的P4片段则不受诱导，但是其包含核心启动子元件，能够启动基因的正常水平表达。P3启动子在PEG处理后未驱动GUS基因的高表达，说明其缺失了干旱/脱水响应元件，P3相对于P2缺失了ABRE、MYB、MYC、DRE和TC-rich repeats，其中DRE被普遍认为是一个干旱/低温/高温/盐应答元件[8]，推测DRE元件在GmPP2C89应答干旱胁迫中起关键作用。

本研究利用转基因拟南芥对GmPP2C89基因的功能做了进一步探究，发现过表达GmPP2C89的拟南芥的耐盐性显著增强。丙二醛(MDA)作为膜脂过氧化的产物，其含量反映了植物细胞因非生物胁迫(包括盐胁迫)而受损的程度[20]，发现盐胁迫下GmPP2C89-OX植株中的MDA含量显著低于WT，证明GmPP2C89-OX植株受盐害较轻。抗氧化酶的活性增强有助于植物减少氧化损伤[21]，因此，检测了抗氧化酶编码基因SOD、POD和CAT的表达水平，发现盐胁迫下GmPP2C89-OX植株中SOD和POD的表达量显著高于WT，说明GmPP2C89在此过程中直接或间接激活了抗氧化系统，进而调节植株对盐胁迫的适应能力。前期报道明确指出，PP2C基因可通过ABA依赖途径参与植物盐胁迫调节网络[12-13]。ABA途径中的关键基因RD26、RD29A和RD29B被多种非生物胁迫和ABA处理诱导上调，被认为是胁迫响应的标记基因[22]。检测RD26、RD29A和RD29B基因的表达水平，结果发现盐胁迫下GmPP2C89-OX植株中RD29B的表达水平显著高于WT，说明GmPP2C89可能通过ABA依赖途径正调控植株耐盐性。