拟南芥MGT6调控高镁条件下Ca2+/Mg2+动态平衡的机制研究

易世鸣,王春平,李 慧,周冰玉,孙翔宇

(湖南省微生物研究院,中国湖南 长沙 410009)

镁离子(Mg2+)是植物细胞质中最丰富的游离二价阳离子,在植物的生长发育中有着十分重要的作用[1～3]。它在植物体中能够作为许多酶的辅助因子参与一系列生理生化反应,同时也作为叶绿素的中心元素参与光合作用[4～8]。

缺镁引起淀粉和蔗糖等碳源在植物叶片中积累,高浓度的蔗糖能够抑制编码叶绿素a/b结合蛋白2的基因CAB2的表达,影响植物光合作用[9～10]。但植物细胞中过量的Mg2+也会抑制植物正常生长发育。当植物中Mg2+过量时,叶片的叶缘部分焦枯,叶尖萎缩泛黄,在更严重的情况下,整个叶片组织全部淡黄,叶肉组织逐渐变为褐色,直至坏死,导致植株的生长发育受阻[11]。高镁胁迫严重影响作物生长[12]。但目前的研究主要针对植物缺镁生理,而对高镁毒害引起的植物生理变化及其机理却了解较少。

有研究表明,浓度较高的Mg2+会促进细胞外部钙离子(Ca2+)被Mg2+所取代,影响细胞壁的稳定性和细胞质膜的渗透性,从而影响植物生长发育[13]。但到目前为止,有关植物细胞钙镁离子(Ca2+/Mg2+)动态平衡的机制报道较少。

镁转运蛋白6(magnesium transporter 6,MGT6)是植物中第一个被报道定位于细胞质膜,并在低镁条件下介导植物根部吸收Mg2+的蛋白质[14]。本研究发现,MGT6的突变体和RNA干扰(RNA interference,RNAi)植株在高镁条件下出现叶片变黄的高镁敏感表型,并且该表型能被一定浓度的Ca2+拮抗,说明拟南芥MGT6能通过调控高镁胁迫下钙镁离子动态平衡来维持植物正常生长发育。该研究将为解析植物响应高镁胁迫的信号网络奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

实验所用的材料为拟南芥(Arabidopsisthaliana)野生型(Columbia生态型,Col-0),种子购买自拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center,US)。拟南芥MGT6基因(At3g58970)的mgt6 T-DNA插入突变体(Salk_203866C)和MGT6 RNAi(#2、#8、#12)种子均为本实验室保存,并已被鉴定为纯合突变体。

1.2 培养基的配制

MS固体培养基(100 mL):4 mL 25×A液,1 mL 100×B-C液,1 mL 100×D液,1 g蔗糖,双蒸水定容至100 mL;用10 mol/L NaOH溶液调节pH至5.8,再加入0.8 g(0.9%)拟南芥培养专用琼脂,121℃高温灭菌2 h。培养基A液、B-C液和D液参照文献[14]配制。

1/6 MS固体培养基(300 mL):2 mL 25×A液,0.5 mL 100×B-C液,0.5 mL 100×D液,3 g蔗糖,双蒸水定容至300 mL;调节pH至5.8,再加入2.8 g(0.9%)拟南芥培养专用琼脂,121℃高温灭菌2 h。

1.3 拟南芥温室培养

用75%乙醇处理拟南芥相关种子5 min,进行表面消毒。春化处理后,将其点植于MS培养基上,于光照培养箱竖直放置培养,培养条件:温度(22±1)℃;光暗周期 16 h(光照)/8 h(黑暗)。

1.4 高镁胁迫处理

将相关拟南芥种子分别种于0 mmol/L、0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、3 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L Mg2+浓度(用1 mol/L Mg2+母液加入相应体积的去离子水配制,1 mol/L Mg2+母液用12 g MgSO4加入100 mL去离子水配制)的1/6 MS固体培养基,用封口膜将培养基封口后放置在温度为(22±1)℃、光暗周期为16 h光照/8 h黑暗的温室中竖直培养。培养14 d后,对野生型植株、mgt6突变体及RNAi植株进行表型观察,并统计植株根长和鲜重。文中将Mg2+浓度＞3 mmol/L定义为高镁条件。

1.5 Ca2+拮抗处理

配制不同 Mg2+浓度(0 mmol/L、0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、3 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L)的 1/6 MS固体培养基,并分别加入1 mmol/L或3 mmol/L Ca2+(用1 mol/L Ca2+母液加入相应体积的去离子水配制,1 mol/L Ca2+母液用 21.9 g CaCl2·6H2O 加入100 mL去离子水配制而成)。将拟南芥野生型种子、mgt6突变体和MGT6 RNAi植株(#8)的种子分别种在上述1/6 MS固体培养基上,用封口膜将培养基封口后放置在温度为(22±1)℃、光暗周期为16 h光照/8 h黑暗的温室中竖直培养7 d。观察表型,并统计植株根长和鲜重。

1.6 统计学处理

所有数据用平均值±标准差()表示。多组间比较采用单因素方差分析,显著性水平为P＜0.05。采用Sigma Plot计算机软件制图。

2 结果

2.1 高镁条件下MGT6突变体及其RNAi植株的表型观察与分析

将野生型(WT)、mgt6突变体和MGT6 RNAi(#2、#8、#12)种子分别种于含不同 Mg2+浓度(0 mmol/L、0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、3 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L Mg2+)的1/6 MS固体平板上,竖直培养14 d后进行表型观察。结果显示:在3 mmol/L Mg2+浓度下,mgt6突变体植株和MGT6 RNAi植株的生长表型与野生型一致;但在高Mg2+浓度(6 mmol/L和8 mmol/L)下,mgt6突变体植株和MGT6 RNAi植株出现叶片变黄、地上部分变小的高镁表型(图1),同时,根长和鲜重均较野生型明显降低(图2)。上述结果表明,MGT6参与植物对高镁胁迫的响应。

图1 不同Mg2+浓度下的拟南芥表型分析(标尺:1 cm)Fig.1 Phenotype analysis of Arabidopsis thaliana under different Mg2+conditions(scale bar:1 cm)

图2 不同Mg2+浓度下的根长和鲜重分析(10个植株)(A)根长;(B)鲜重。*代表与WT相比有显著性差异(P＜0.01)。Fig.2 Root length and fresh weight analysis of Arabidopsis thaliana under different Mg2+conditions(10 plants)(A)Root length;(B)Fresh weight.Asterisks represent significant difference compared with WT(*P＜0.01 by Student’s t test).

2.2 Ca2+拮抗MGT6突变体及其RNAi植株高镁表型的分析

有研究表明Mg2+能和Ca2+互作来调控植物生长发育[14]。为了验证高镁条件下拟南芥MGT6是否能通过调节Ca2+/Mg2+动态平衡来维持植物正常生长发育,我们将拟南芥哥伦比亚野生型(WT)、mgt6突变体和随机挑选的MGT6 RNAi(#8)种子分别种在含不同Mg2+浓度(0 mmol/L、0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、3 mmol/L、6 mmol/L 和 8 mmol/L)的1/6 MS固体培养基上,且在各培养基中分别添加3 mmol/L Ca2+,竖直培养7 d后进行表型观察。结果显示:在低镁条件(0 mmol/L、0.01 mmol/L、0.1 mmol/L Mg2+)下,加入3 mmol/L Ca2+后,mgt6突变体植株和MGT6 RNAi(#8)植株的低镁表型不能得到恢复;但在高镁条件(6 mmol/L、8 mmol/L Mg2+)下,加入3 mmol/L Ca2+后,mgt6突变体植株和MGT6 RNAi(#8)植株的高镁表型得到缓解,叶片开始变绿,各植株长势均恢复至野生型水平(图3)。进一步的统计学分析显示,mgt6突变体植株和MGT6 RNAi(#8)植株的根长和鲜重均恢复到野生型水平(图4)。上述结果表明,Ca2+不能缓解mgt6突变体植株及MGT6 RNAi植株的低镁表型,但能够有效拮抗mgt6突变体及RNAi植株的高镁敏感表型。

图3 Ca2+拮抗mgt6突变体及RNAi植株的高镁表型Fig.3 Phenotype analysis of mgt6 mutants and RNAi plants under high-Mg2+conditions after Ca2+supplement

图4 Ca2+拮抗mgt6突变体及RNAi植株高镁表型的分析(5个植株)(A)根长;(B)鲜重。*代表与WT相比有显著性差异(P＜0.01)。Fig.4 Phenotype analysis of mgt6 mutants and RNAi plants under high-Mg2+conditions after Ca2+supplement(5 plants)(A)Root length;(B)Fresh weight.Asterisks represent significant difference compared with WT(*P＜0.01 by Student’s t test).

2.3 Ca2+拮抗MGT6突变体及其RNAi植株高镁表型的细胞学分析

为了探究Ca2+拮抗mgt6突变体及MGT6 RNAi植株高镁表型的机制,我们进一步进行了mgt6突变体及RNAi植株在不同浓度Ca2+处理下的细胞学分析。结果显示:高镁胁迫(6 mmol/L Mg2+)处理下,mgt6突变体和MGT6 RNAi(#8)植株的叶肉细胞形态不规则、皱缩(图5),且较野生型明显缩小,仅为野生型叶肉细胞大小的49.1%(图6);但当在高镁培养基(6 mmol/L Mg2+)中加入1 mmol/L Ca2+后,mgt6突变体和MGT6 RNAi(#8)植株的叶肉细胞形态明显变规则,皱缩现象减轻(图5),同时,叶肉细胞大小也逐渐得到恢复,恢复至野生型叶肉细胞大小的57.2%(图6);当在高镁培养基(6 mmol/L Mg2+)中加入 3 mmol/L Ca2+后,mgt6 突变体和MGT6 RNAi(#8)植株的叶肉细胞形态、大小均逐渐恢复至野生型水平(图5,图6)。上述结果进一步说明,mgt6突变体和MGT6 RNAi(#8)植株的高镁敏感表型能被一定浓度的Ca2+拮抗,MGT6能通过调控细胞钙镁离子动态平衡来响应高镁胁迫。

图5 高镁条件下不同浓度Ca2+对mgt6突变体及RNAi植株叶肉细胞形态的影响(标尺:10 μm)Fig.5 Influence of different Ca2+concentrations on the morphology of mesophyll cells of mgt6 mutants and RNAi plants treated with a high Mg2+concentration(scale bar:10 μm)

图6 不同浓度Ca2+对高镁(6 mmol/L Mg2+)处理下mgt6突变体及RNAi植株叶肉细胞大小的影响*代表与WT相比有显著性差异(P＜0.01)。Fig.6 Influence of different Ca2+concentrations on the size of mesophyll cells of the mgt6 mutants and RNAi plants treated with a high Mg2+concentration(6 mmol/L)Asterisks represent significant difference compared with WT(*P＜0.01 by Student’s t test).

3 讨论

镁是植物生长发育所必需的营养元素之一,在植物的生长发育中起着非常重要的作用。但到目前为止,有关植物吸收和运输Mg2+的分子机制报道较少。MGT6是植物中第一个被报道定位于细胞质膜,并在低镁条件下介导植物根部吸收Mg2+的蛋白质。本研究发现,MGT6的突变体和RNAi植株对高镁敏感,该高镁表型能被一定浓度的Ca2+拮抗。这说明MGT6可能通过调控钙镁离子动态平衡来响应高镁胁迫。

Ca2+和Mg2+是植物中十分丰富的二价阳离子,二者在植物细胞中可能具有拮抗作用,因此植物通过钙镁离子含量之间的平衡以获得最适的生长和发育。维持这种平衡以应对土壤营养变化是植物矿物营养的重要特征。研究发现,植物能感知营养变化并经过信号转导来调节转运蛋白活性,从而适应环境营养变化[13～14]。目前,人们已鉴定出一些离子通道和转运蛋白家族,它们帮助Ca2+、Mg2+跨质膜和细胞内膜转运。在细胞和植株水平协调这些转运系统的活性可控制Ca2+和Mg2+的营养水平[11]。植物中钙镁离子含量的平衡紧密相连,并且可能(至少部分)由共同的信号网络调节。但到目前为止,研究人员对植物通过钙镁平衡来响应高镁胁迫的分子机制还了解甚少。

本研究发现,拟南芥镁转运体MGT6的突变体mgt6和RNAi植株具有地上部分矮小、叶片发黄、叶鲜重显著下降的高镁敏感表型,这种高镁表型能被外源施加的一定浓度的Ca2+互补。叶片细胞显微结构的比较分析显示:高镁条件下,mgt6突变体及MGT6 RNAi植株的叶肉细胞减小,形态不规则;但随着培养基中Ca2+浓度的增加,mgt6突变体及RNAi植株的叶肉细胞逐渐增大,细胞形态逐渐变得规则,当在培养基中加入3 mmol/L Ca2+时,突变体及RNAi植株的叶肉细胞大小和形态恢复到野生型水平。这进一步说明,mgt6突变体及MGT6 RNAi植株的高镁敏感表型能被一定浓度的Ca2+拮抗。

综上所述,MGT6在高镁条件下能通过参与植物钙镁离子动态平衡来响应高镁胁迫,维持植物在高镁胁迫下的正常生长发育。但在高镁条件下,MGT6诱导出植物细胞特异的Ca2+信号来维持植物Mg2+动态平衡进而响应高镁胁迫的分子机制还有待进一步研究。另外,对于Ca2+/Mg2+平衡,我们应继续完善调节和协调土壤营养状态不断变化下的Ca2+、Mg2+转运过程的信号网络。总的来讲,揭示植物Ca2+和Mg2+平衡的分子机制将有助于改善作物的营养特性,从而提高作物产量,最终提高人类的健康水平。