基于LTB4/BLTR通路探讨黄芩苷-栀子苷配伍对局灶性脑缺血大鼠再灌注损伤的影响

周爽，李慧敏，张行行，史永恒，王川，王国全，李敏，王斌（陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046）

脑缺血损伤可触发一系列的有害事件，包括谷氨酸相关的兴奋性毒性、炎症、氧化应激和细胞凋亡。近年来，越来越多的研究关注炎症在脑缺血发病中的作用。缺血性病变中分泌的炎症介质，包括细胞因子、前列腺素、自由基和趋化因子，可以招募其他免疫细胞，参与已经过度激活的炎症反应，导致脑细胞进一步损伤。因此，调节炎症相关通路，减少炎症因子的释放，对改善脑损伤具有重要意义。白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）是不饱和脂肪酸通过5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）途径中重要的下游代谢产物，与细胞膜上的白三烯受体（leukotriene B4 reportor，BLTR）结合。BLTR即BLT1 和BLT2，参与并增强炎症反应。越来越多的证据表明，血浆中LTB4 水平可以作为急性脑卒中患者临床预后不良的生物标志，但LTB4 在脑损伤中的作用机制尚不明确。

黄芩苷（BC）、栀子苷（GP）是中药黄芩和栀子的主要活性成分。依据中医基础理论“清热解毒”的现代化研究，课题组的前期实验研究发现，BC/GP（最佳配伍比例7∶3）联合应用可减轻脑缺血大鼠缺血区的炎性损伤和组织水肿，可缓解脑缺血损伤后的炎症反应，并通过下调5-LOX 起到脑保护的作用。有研究指出，抑制5-LOX 的净效应可能掩盖了LTB4 的作用，如影响中性粒细胞浸润和细胞因子等作用。为进一步探讨BC/GP 是否调控LTB4 发挥抗脑缺血损伤的作用机制，本实验建立脑缺血大鼠再灌注模型，探讨LTB4 通路在脑缺血再灌注中的作用机制，及BC/GP 是否可以有效调控LTB4/BLTR 通路降低脑损伤，为进一步研究缺血性脑卒中的诊断和临床治疗提供依据。

1 材料

1.1 仪器

大鼠LTB4-ELISA 试剂盒（深圳欣博盛科技有限公司，批号20160712）；ElX800 酶标仪（Bio-TEK 公司）；miniprotean3cell 电泳仪（Bio-R-AD 公司）；Milli-Q 纯水机（Millipore 公司）；5430R 型冷冻离心机（Eppendorf 公司）。

1.2 试药

黄芩苷、栀子苷（北京索莱宝生物公司，含量≥98%，批号：20201007）；白三烯B4 受体阻断剂LY255283（abcam，HY-15744）；BLT1抗体（abcam，ab95492）；BLT2 抗体（abcam，ab115453）；肿瘤坏死因子-

α

（TNF-

α

）、髓过氧化物酶（MPO）、白介素-1

β

（IL-1

β

）、白三烯B4（LTB4）ELISA 检测试剂盒（武汉博士德）。

1.3 动物

SPF 级SD 雄性大鼠120 只，体质量180 ～220 g[许可证号SCXK（川）2020-030，成都达硕实验动物有限公司，于陕西中医药大学中药药理实验室饲养]。适应性喂养一周，自由饮食饮水。

2 方法

2.1 药品制备

根据给药剂量不同，称取一定量黄芩苷、栀子苷药物粉末，共同溶剂于适量纯净水中，超声10 min，至4℃冰箱保存，药液使用前振摇混匀。取LY255283 粉末10 mg 溶解于DMSO 中，定容至10 mL 备用。

2.2 分组及造模

将SD 雄性大鼠随机分为7 组，每组15 只，分别为假手术组（sham），模型组（model），白三烯B4 受体抑制剂组（LY255283，1 mg·kg），黄芩苷-栀子苷7∶3 配伍组低、高剂量组（BC/GP 组，45 mg·kg、60 mg·kg）和BC/GP 联合抑制剂组（BC/GP45 ＋LY255283、BC/GP60 ＋LY255283）。适应性喂养一周后，除假手术组外，其余组采用线栓法制备大脑中动脉栓塞（MCAO）模型。大鼠经麻醉后，仰卧位固定于手术板上，颈部去毛，消毒，纵向切开颈部正中皮肤，逐层钝性分离颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，结扎颈外动脉，在颈总动脉上距离颈内动脉交叉 5 mm处造口，插入线栓，至有微弱阻力时停止，扎紧线栓以防止滑落，缝合伤口，缺血后2 h 拔栓，恢复血流供应；假手术组相同处理但不进行结扎、造口和插栓操作。各组术后于（23±2）℃条件下喂养，正常饮食进水。

2.3 给药

大鼠适应性饲养一周后，按照BC/GP 45 mg·kg和60 mg·kg（1 mL/100 g）灌胃给药，连续7 d，每日一次。LY255283 组、BC/GP45 ＋LY255283 组、BC/GP60 ＋LY255283 组在手术造模前30 min 腹腔注射LY255283（1 mg·kg），假手术组和模型组注射等体积的生理盐水。

2.4 神经功能评价

大鼠称重后，用10%水合氯醛（0.3 mg·kg）腹腔注射麻醉，通过改良Longa 线栓法来建立大脑中动脉局灶性梗死MCAO 模型（右侧）。缺血2 h 后松开动脉夹再灌注24 h。神经功能学评分参考Zea-Longa 5 分制评分标准，所有大鼠均在模型成功后观察大鼠行为。评分标准为0 分：无神经功能缺陷征；1 分：一侧前肢部分屈曲；2 分：一侧前肢完全屈曲；3 分：向偏瘫侧转圈；4 分：向偏瘫侧倾倒；5 分：不能自发行走，意识丧失。大鼠手术苏醒后，进行Zea-Longa 评分，评分1 ～4 分则纳入实验。拔出线栓，再灌注24 h 观察并记录神经功能缺损症状，进行神经严重程度评分（mNSS）。

2.5 大鼠脑组织切片HE 染色

脑组织4%多聚甲醛固定脑组织，梯度浓度乙醇脱水，二甲苯脱醇；浸蜡包埋；切片，厚度5 μm；再以二甲苯、乙醇脱蜡；苏木素浸泡20 min，酸水分化；纯净水浸泡20 min；0.5%伊红染色2 min，冲洗；梯度乙醇脱水，树脂封片。在病理显微镜下拍照。

2.6 酶联免疫法检测相关因子在脑组织含量

采用ELISA 试剂盒检测脑梗死皮层的大鼠脑组织白三烯A4 水解酶（LTA4H）、LTB4、MPO 和炎性因子的含量。24 h 取材，将脑组织置于液氮后，研磨后取上清液，严格按照试剂盒操作测定。

2.7 Real-time PCR 检测BLTR 在脑组织中的含量

取匀浆管，加入1 mL 的RNA 提取液，置冰上预冷。取100 mg 组织，加入到匀浆管中。匀浆仪充分研磨直至无可见组织块。样本前处理之后，12 000 r·min离心10 min 取上清液。加入250 μL 三氯甲烷，颠倒离心管15 s，充分混匀，静置3 min，4℃、12 000 r·min，离心10 min，将400 μL 上清液转移到一新的离心管中。加入0.8 倍体积的异丙醇，颠倒混匀。－20℃放置15 min。4℃、12 000 r·min离心10 min，管底的白色沉淀即为RNA。溶解RNA 将离心管置于超净台上吹3 min，加入15 μL 无RNA 酶的水溶解RNA，55 ℃ 孵育5 min。检测RNA 浓度。进行反转录，反应体系：5×Reaction Buffer 4 μL、dT引物（100 μmol·L）0.5 μL、dNTP 混合物（100 μmol·L）0.5 μL、反转录酶1 μL、总 RNA 10 μL、DEPC 处理水添加20 μL。取0.2 mL PCR 管，配制如下反应体系：2×qPCR Mix、7.5 μL 2.5 μmol·L基因引物 1.5 μL、反转录产物 2.0 μL、ddHO 4.0 μL，每个反转录产物配制3 管。定量PCR 扩增反应条件：95 ℃预变性10 min，95℃、15 s，60 ℃、30 s，熔解曲线 60 ～95℃，每升温0.5℃采集一次荧光信号（循环40 次）。以GAPDH 为内参，采用2法计算mRNA 相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列
Tab 1 Primer sequence

基因名称F（5'→3'）R（5'→3'）LTA4HGGAGAAAGCCAGGGTTACAAAGTGCTTTCCTGAAGTCTGCTCG BLT1TTTCCTACACTTTCTGGCTCGGTTCTTGGGTGTTACTGTGCGGT BLT2GAGACCCTGACTGCCTTCGTCGCCTGTAGGAGATTGACCG GAPDHCTGGAGAAACCTGCCAAGTATGGGTGGAAGAATGGGAGTTGCT

2.8 统计分析

所有统计分析均使用Graphpad Prism 5 软件进行。实验数据以

x

±

s

表示。同一时间点的比较采用独立样本

t

检验。多组之间比较采用单因素方差分析，两组间资料比较采用LSD 检验。

P

＜0.01 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 BC/GP 对脑缺血大鼠再灌注神经功能损伤的影响

如图1 所示，与假手术组比，手术造模后大鼠神经功能损伤严重，麻醉苏醒后出现在水平地面上向轻瘫侧倾倒行为，再灌注24 h 后向轻瘫侧转圈，提尾表现为前肢屈曲，头部在30 s 内偏离垂直轴＞10°或出现癫痫、肌阵挛、肌张力障碍等行为，平衡木测试中出现试图在平衡木上平衡但跌落（＞20 s）的现象。与模型组相比，LY255283 组神经功能评分无明显差异。BC/GP组大鼠行为表现相似，各项评分较模型组差异有统计学意义（

P

＜0.01），BC/GP 联合抑制剂组的神经损伤显著降低（

P

＜0.01，

P

＜0.001）。假手术组无神经功能障碍的表现。结果表明BC/GP可以降低神经功能损伤。

图1 各组脑缺血再灌注大鼠神经功能评分结果（n ＝15）Fig 1 Neurological function score of rats with cerebral ischemiareperfusion in each group（n ＝15）

3.2 BC/GP 调控LTB4 通路对大鼠脑组织病理形态的影响

HE 染色结果显示，与假手术组相比，脑缺血再灌注后脑组织大范围损伤，损伤处组织肿胀变大，着色明显变淡；皮层和纹状体区神经元大量坏死，神经元数量减少，多见胞核固缩或消失，可见散在的炎性细胞浸润；神经纤维结构松散，纹状体神经纤维团结构模糊等现象。部分神经元胞体和胞核肿胀，核质疏松，神经纤维水肿，结构松散，纤维团破裂，有的结构模糊不清；局部纹状体下方明显坏死，结构疏松；纹状体神经纤维团结构模糊，有的甚至液化，结构疏松。与模型组相比，LY255283 组病理形态得到改善，BC/GP 组纹状体结构松散减轻，神经坏死现象明显改善。BC/GP 联合抑制剂组的神经坏死现象也有改善。假手术组的脑组织各结构清晰，着色均匀，未见明显梗死灶。结果表明抑制LTB4 受体的表达改善病理形态的效果并不明显，BC/GP 可以有效改善脑组织病理形态（见图2）。

图2 各组大鼠缺血侧脑组织皮质部分形态学观察（HE，×20）Fig 2 Morphological of cerebral cortex on ischemic side of rats in each group（HE，×20）

3.3 BC/GP 对脑缺血大鼠再灌注后脑组织中LTA4H、LTB4 和血清中LTB4 的影响

与假手术组相比，脑缺血再灌注后脑组织中LTA4H、LTB4 和血清中LTB4 的表达显著增加（

P

＜0.01）；与模型组相比，LY255283组LTA4H 和LTB4 的表达显著降低（

P

＜0.05，

P

＜0.01），BC/GP 组 LTB4 和LTA4H 的表达显著降低（

P

＜0.01）。并且BC/GP（60 mg·kg组）可以降低血清中 LTB4 的表达（

P

＜0.05)。结果表明，BC/GP 配伍可以显著降低LTB4 的表达，提示BC/GP 可能可以通过抑制LTB4 在脑缺血后发挥作用（见图3）。

图3 脑缺血再灌注后LTB4 的测定结果（n ＝3）Fig 3 LTB4 and MPO after the cerebral ischemia-reperfusion（n ＝3）

3.4 BC/GP 对脑缺血大鼠再灌注后脑组织中MPO的影响

MPO 是中性粒细胞的阳性标记物。如图4所示，与假手术组相比，脑缺血再灌注后脑组织中MPO 的表达显著增加（

P

＜0.01）；与模型组相比，LY255283 组的MPO 表达显著降低（

P

＜0.01），给予BC/GP 显著降低MPO 的表达（

P

＜0.05，

P

＜0.01）。结果表明，BC/GP 可以降低脑损伤后MPO 的表达和中性粒细胞浸润。

图4 脑缺血再灌注后MPO 的测定结果（n ＝3）Fig 4 Expression of MPO after the cerebral ischemia-reperfusion（n＝3）

3.5 BC/GP 对脑缺血大鼠再灌注后脑组织中BLT1 和BLT2 mRNA 的影响

RCR 结果显示，与假手术组相比，脑缺血再灌注后BLT1 和BLT2 的mRNA 显著升高（

P

＜0.01）；与模型组相比，LY255283 显著抑制BLT1 和BLT2 mRNA 的表达（

P

＜0.01），BC/GP显著降低BLT1 和BLT2 mRNA 的表达（

P

＜0.01），BC/GP 联合LY255283 显著抑制BLT1 用和BLT2 mRNA 的表达（

P

＜0.01）。结果表明BC/GP 可以抑制LTB4 与BLT1 和BLT2 受体结合而发挥作用（见图5）。

图5 各组BLT1 和BLT2 mRNA 的测定结果（n ＝3）Fig 5 BLT1 and BLT2 mRNA in each group（n ＝3）

3.6 BC/GP 调控LTB4 通路对脑缺血大鼠再灌注后脑组织中炎性因子的影响

如图6 所示，与假手术组相比，脑缺血大鼠再灌注24 h 后大鼠脑组织中促炎因子TNF-

α

和炎性因子IL-1

β

表达显著增加（

P

＜0.01）；与模型组相比，LY255283 组TNF-

α

的表达显著降低（

P

＜0.01）。 给予BC/GP 以及BC/GP 联合LY255283 可以显著降低TNF-

α

和IL-1

β

表达（

P

＜0.01）。结果表明，抑制LTB4/BLTR 表达来影响炎性因子的释放，下调LTB4 通路的表达会降低脑缺血后炎性因子的表达。BC/GP（7∶3）配伍可以降低炎性因子和改善脑损伤，其抗炎作用可能与下调LTB4/BLTR 通路有关。

图6 各组炎性因子TNF-α 和IL-1β 的测定结果（n ＝3）Fig 6 TNF-α and IL-1β inflammatory factor in each group（n ＝3）

4 讨论

脑缺血后缺血损伤区存在多种细胞因子表达、炎性细胞浸润和氧自由基反应，可加速缺血后细胞损伤。缺血再灌注损伤是缺血性脑卒中进展过程中最重要的部分，能量代谢异常，离子代谢紊乱、自由基损伤、炎症反应等都参与了缺血再灌注损伤的复杂病理机制。炎症反应在脑缺血损伤发生后被激活，导致神经细胞凋亡、死亡和组织损伤。LTB4 主要在巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞中表达，与细胞表面G 蛋白偶联受体结合，即LTB4 的受体（BLTR），产生多种细胞内信号。LTB4 能激活粒细胞，生成超氧阴离子，对白细胞具有强效的活化作用，刺激白细胞趋化、聚集、释放氧自由基和溶酶体酶，使血管通透性增加，血管壁收缩，这些生理特性被认为加重了缺血引起的细胞损伤。近年来不断有研究发现，在大鼠脑缺血中心区中，神经元和小胶质细胞BLT4 合成增加。在脑缺血模型前颈动脉注射LTB4 可增加梗死组织的体积，皮瓣抑制剂BAY-X1005 和BLT 拮抗剂LY255283可减少梗死体积。上述结果证明LTB4 在脑缺血中的产生是有害的，可使组织梗死程度恶化。本研究检测了LTB4 在急性大鼠脑卒中模型中的水平及其机制，结果证实了在脑缺血再灌注损伤后LTB4 表达显著增加。

目前已知BLTR 有两种亚型，即BLT1 和BLT2。LTB4 通过BLT1 引起炎症趋化因子和细胞因子的释放，BLT1 参与了许多炎症性疾病，如中性粒细胞在病变部位积聚。有报道称，BLT2激活导致活性氧（ROS）升高，随后激活NF-

κ

B。LY255283 是一种非选择性拮抗剂，可同时抑制BLT1（非竞争性）和BLT2（竞争性）介导的Ca动员。因此，所观察到的LY255283 的保护作用可能涉及其中一种或两种亚型。有研究表明，5-LOX 炎症途径在许多疾病中均被激活，引起炎症反应，BLT1 和BLT2 是主要的促炎介质。5-LOX 的抑制剂也具有脑保护作用，BLT1 拮抗作用在于不干扰除LTB4 外的脂质代谢物，相比于5-LOX 可作为更有优势的治疗靶点，因此，抗炎和神经保护作用的净效应应该比在5-LOX 抑制的情况下更为显著。并且与BLTR 拮抗剂相比，5-LOX 抑制剂选择性较低，消耗多种产物，其中包括对缺血损伤有益的产物（如脂素A4 是5-LOX 的抗炎产物，可以抑制白三烯合成，对脑缺血具有神经保护作用），因此，BLTR 拮抗剂应该是比5-LOX 抑制剂更好的选择。当缺血性脑损伤发生时，激活免疫反应，进而诱发一系列级联反应如炎症反应中TNF-

α

和IL-1

β

等的表达，加剧脑损伤。中性粒细胞浸润被认为是缺血再灌注损伤主要的潜在的机制之一。MPO 是中性粒细胞的阳性标记物，本实验结果表明，在急性脑缺血脑损伤中，LTB4、MPO 和炎性因子的表达显著增加，LY255283 可降低脑损伤组织中IL-1

β

和TNF-

α

表达，表明其可阻断LTB4 通路有效抑制炎性因子的产生，从而减轻炎性损伤。LY255283 还可降低MPO 的表达和中性粒细胞浸润，改善脑缺血再灌注的损伤。脑损伤后LTB4 表达显著增加，LTA4H 是合成LTB4 的关键酶。BC/GP 可以显著抑制LTA4H/LTB4/BLTR 的表达，减轻神经功能缺陷，降低白细胞浸润，改善脑组织的病理形态变化。BC/GP可以减轻神经功能损伤，显著降低急性脑缺血时期的炎性因子表达，降低中性粒细胞浸润。说明BC/GP 可以通过抑制LTB4 通路起到脑保护的作用。此外，实验结果发现BC/GP（7∶3）配伍联合LY255283 对LTB4/BLTR 通路的抑制作用显著增强，推测BC/GP 可能通过多种途径抑制了LTB4/BLTR 通路。

综合以上结果，BLTR 抑制剂可以起到抗炎和神经保护的作用，BC/GP 可以通过下调LTB4/BLTR 通路在脑缺血再灌注损伤中起到脑保护作用。后续将建立体外细胞模型研究LTB4/BLTR在脑缺血再灌注损伤中的作用机制，并且进一步阐述黄芩苷-栀子苷配伍对脑缺血损伤的保护作用机制。