一株高效氯嘧磺隆降解菌的分离鉴定及其降解机理初探

韩晓艳，阮志勇，江 旭，周义清，张庆华

（1．江西农业大学生物科学与工程学院，江西 南昌 330045；2．中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081；3．西藏农牧学院资源与环境学院，西藏 林芝 860000）

氯嘧磺隆（Chlorimuron-ethyl）是美国杜邦公司于20世纪80年代研制的一种磺酰脲类除草剂，被广泛应用于大豆田中的阔叶杂草、莎草及某些禾本科杂草的防治。该除草剂残效期长达2～3年，长期大量施用极易对后茬敏感作物造成药害，在土壤中沉积可致敏感作物大量减产，形成大豆田轮作障碍［1］。在2004～2006年，牡丹江市应用氯嘧磺隆，乙草胺封闭除草发生药害面积达12.23万hm2，经济损失上千万元［2］。残留的氯嘧磺隆会降低土壤酶活性，改变土壤微生物群落结构，导致土壤生产力下降，严重影响了农业结构调整，对生态环境和人类健康也会产生潜在威胁［3-6］。因此，减少此类除草剂在土壤中的残留成为当前的研究热点。

消除农业生产氯嘧磺隆等除草剂残留，是现代农业绿色发展的关键。目前减轻甚至解除环境中磺酰脲类除草剂污染的措施主要包括化学水解和微生物降解，其中微生物代谢作用显著［7］。筛选获得高效氯嘧磺隆降解菌株是氯嘧磺隆污染土壤的微生物修复技术的核心和关键。目前已经报道的具有氯嘧磺隆降解能力的微生物有真菌，如掷孢酵母Sporobolomycessp.在含有10 mg/L氯嘧磺隆的麦芽汁液体培养基96 h后对氯嘧磺隆的降解率为90.12%；黑曲霉Aspergillus niger培养7 d后，可将初始浓度为10 mg/L的氯嘧磺隆降解，降解率达96.59%［8-11］。细菌如假单胞菌Pseudomonassp. LW3，7 d内可降解70%～80%初始浓度为50 mg/L的氯嘧磺隆；克雷伯氏菌Klebsiella jilinsis2N3在30℃、12 h内对100 mg/L氯嘧磺隆的降解率达92.5%；Hansschlegeliasp. CHL1在30℃、4 d可降解95%浓度为50 mg/L的氯嘧磺隆；红球菌Rhodococcussp. D310-1在28℃、5 d可将100 mg/L氯嘧磺隆降解89%；嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophiliaD310-3在 pH 5.95、30.15℃条件下，6 d后可降解89.9%浓度为50.21 mg/L的氯嘧磺隆，路德维希氏肠杆菌Enterobacter ludwigii在pH 7.0、30℃条件下，21 d后可降解90.8%浓度为10 mg/L的氯嘧磺隆［1，12-18］。此外，也有研究人员对菌株的降解途径和功能基因及酶进行了研究。据报道，Ancylobactersp.XJ-412-1的carboxyesterase基因可将磺酰脲转化为其脱酯衍生物，从而降解磺酰脲类除草剂（甲磺隆）［19］。克隆了一个新的酯酶基因sulE，并在Hansschlegelia zhihuaiaeS113中表达，而该酯酶能够利用去酯化机制降解磺酰脲类除草剂［20］，分离并在Bacillus subtilisJH3中鉴定出糖基转移酶，通过破坏S-N键，降解甲磺隆［21］。

目前已报道的氯嘧磺隆降解菌种类相对较少，仅分布在Rhodotorula、Enterobacter、Pseudomonas、Klebsiella等9个属内，且降解效果并不突出。因此，继续深入挖掘氯嘧磺隆高效降解菌株，丰富降解资源多样性十分必要，为构建高效降解氯嘧磺隆基因工程菌和生产优质降解菌剂提供支撑。本研究从安徽合肥某磺酰脲类除草剂生产厂废水处理活性污泥中分离出一株以氯嘧磺隆为唯一氮源的高效降解菌，对其进行分类鉴定及降解特性研究，并对其降解氯嘧磺隆的代谢途径及相关降解基因进行探索，为该类除草剂污染环境的生物修复提供优良的降解微生物资源，也为氯嘧磺隆生物降解提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

供试样品采自安徽合肥某磺酰脲类除草剂生产厂废水处理池的活性污泥中，采集后装入灭菌自封袋中带回实验室，用于氯嘧磺隆降解菌的分离。

1.1.2 主要试剂

氯嘧磺隆标准品购自合肥久易农资公司，纯度为≥98%，Taq DNA聚合酶（MT201）、dNTPs、DNA Marker、所用引物购自北京博迈德有限公司，甲醇、乙腈等有机试剂均为色谱纯，购自赛默飞世尔科技公司。

1.1.3 培养基

MSM培养基（g/L）：MgSO4·7H2O 0.2、KH2PO40.5、K2HPO40.5、NaCl 0.2、CaCl20.1，pH 7.0；GSM培养基（g/L）：MgSO4·7H2O 0.2、KH2PO40.5、K2HPO40.5、NaCl 0.2、CaCl20.1、Glucose 5，pH 7.0；Luria-Bertani LB培养基（g/L）：酵母提取物5、胰蛋白胨10、NaCl 10、Agar 20，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 氯嘧磺隆降解菌的富集与分离

取10 g污泥样品，加入100 mL MSM培养基（含100 mg/L氯嘧磺隆）中，置于恒温摇床中，在30℃避光振荡培养（160 r/min）。培养7 d后，取10 mL培养液接入100 mL新鲜MSM无机盐培养基中，每次提高氯嘧磺隆浓度100 mg/L，并使氯嘧磺隆终浓度达到500 mg/L。取最终富集的培养液，稀释涂布至MSM固体培养基上（含100 mg/L氯嘧磺隆），于30℃条件下避光培养2 d，挑取生长较快的单菌落，经平板划线纯化，再分别接入含 50mg/L的氯嘧磺隆GSM培养液中，测量其降解能力，选取降解能力较强的菌株保存用于后续研究。

1.2.2 氯嘧磺隆降解菌的初步鉴定

形态特征鉴定：采用平板涂布法接种，30℃恒温培养2 d后观察菌落形态；采用革兰氏染色法确定菌株革兰氏类型。同时对获得的降解菌进行16S rRNA基因扩增与测序，并对测序结果进行分析，具体如下：利用细菌基因组提取试剂盒（天根生物科技有限公司）提取菌株的基因组DNA，以此为PCR扩增模版，利用细菌16S rRNA基因的通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）进行扩增。PCR扩增反应体系为Taq PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，1492R 1 μL，27F 1μL，DNA template 2 μL；总体积为25 μL。PCR反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30个循环，最后72℃延伸5 min。扩增产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，预计产物大小为1500 bp左右。将PCR产物送到北京博迈德有限公司进行测序。将测序结果提交至EzBioCloud进行序列比对，根据比对结果，下载相关模式菌株的16S rRNA基因序列，使用MEGA 7.0构建系统发育树并分析。

1.2.3 氯嘧磺隆降解菌降解能力的测定

将分离到的菌株接种于GSM培养基中，于30℃、160 r/min的恒温振荡器上培养24 h后，将培养菌液在8000 r/min的转速下离心5 min后，弃上清，菌体用新鲜的0.9% NaCl生理盐水洗涤3次后重悬，以5%接种量加入含有50 mg/L氯嘧磺隆的GSM培养基中，于30℃、160 r/min条件下避光培养，研究降解菌对氯嘧磺隆的降解效果。检测采用高效液相色谱法，具体检测条件为色谱柱C18 反 相 柱（5 μm，4.6×150 mm i.d.，Diamonsil，USA），流动相为甲醇∶水∶冰乙酸=68∶32∶0.1（V∶V∶V），柱温为28℃，检测波长240 nm，进样量为10 μL，流速为1 mL/min。依据检测波长为240 nm处氯嘧磺隆的峰面积结果，通过标准曲线换算出培养液中氯嘧磺隆的浓度，再根据公式降解率（%）=（1-实测残量/对照样实测残量）×100计算降解能力［22-23］。

1.2.4 氮源对氯嘧磺隆降解菌LAM2021降解能力的影响

将5 mL的LAM2021菌悬液（OD600为1.0）接种于100 mL含有不同氮源（CK、硫酸铵、磷酸二氢铵、尿素、蛋白胨、氯化铵）的GSM培养基中，置30℃、160 r/min条件下培养，每个处理设3次重复。

1.2.5 氯嘧磺隆降解菌降解特性及降解条件优化

菌株的降解特性研究包括菌株对温度、pH及不同除草剂浓度的降解能力。设置不同温度（20、30、40℃）、不同除草剂浓度（0、50、100 mg/L）、不同pH（5.0、7.0、9.0），研究不同条件对菌株LAM2021降解氯嘧磺隆的影响。每个处理设3次重复。将菌株接种至不同条件下含氯嘧磺隆的GSM培养基中作为处理组，以相同条件下不接入菌株为对照组。分别培养3、6、9 h后，取样测定样品中氯嘧磺隆残留的浓度并根据1.2.3中的公式计算降解率。

利用Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken design（BBD）模型进行3因素3水平试验设计，以pH（A）、温度（B）、底物浓度（C）为自变量，以降解率为唯一响应值。二次回归方程用以拟合自变量和响应值之间的函数关系。

1.2.6 短链有机酸的鉴定

利用HPLC检测并鉴定菌株LAM2021在GSM培养基中产短链有机酸的情况，检测条件：流动相为磷酸二氢铵（0.02 mmol/L，pH=2.7）与甲醇混合物（比例为85∶15，V∶V），进样量为10 μL，光电二极管阵列检测器的波长为210 nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，以分析纯级草酸、L-苹果酸、柠檬酸和富马酸作为参照标样。

1.2.7 菌株降解氯嘧磺隆中间代谢产物的检测与代谢途径推测

将菌株LAM2021接种于LB培养基中，培养至指数生长期，将培养液于8000 r/min条件下离心5 min，丢弃上清，收集菌体，用磷酸缓冲液洗涤2次后制成OD600为1.0的菌悬液。以5%的接种量，将LAM2021菌悬液（OD600=1.0）接种到含50 mg/L氯嘧磺隆的GSM培养基中，以相同条件但不接菌为对照，分别培养1 d后取样，上述所有实验均设3次重复。使用配备电喷雾电离Xevo三重四极杆（Xevo-TQD）质谱仪（Waters Corp，Milford，MA，USA）进行检测。质量模式m/z为100～450，Masslynx NTV的正模式（ESI+）和负模式（ESI-）的ESI源被用于收集和分析获得的数据。

1.2.8 氯嘧磺隆降解菌全基因组测序及分析

将菌株LAM2021接种到LB液体培养基中，在160 r/min和30℃条件下振荡培养2 d后，8000r/min离心5 min，用磷酸缓冲液洗涤，收集足量菌体，送至广东美格基因科技有限公司开展全基因组测序工作，具体流程参考文献［24］。菌株全基因序列文件组装完成后，分析预测编码基因、非编码RNA、重复序列、CRISPR等基因组成分，并使用KEGG、GO、Swissprot、NR、COG等数据库对编码基因序列进行功能注释。结合已报道和本实验中获得的对微生物降解氯嘧磺隆的信息，搜索并预测与降解相关的功能基因及其信息。

2 结果与分析

2.1 氯嘧磺隆降解菌的分离

经过富集培养和平板稀释涂布分离，自磺酰脲类除草剂生产废水处理池污泥中分离获得1株对氯嘧磺隆具有高效降解效果的菌株LAM2021，11 h内对50 mg/L浓度的氯嘧磺隆降解率达到90%以上，对该菌株进行后续研究。该菌株为革兰氏阴性菌（图1A），在LB固体培养基上，菌落呈白色，不透明，表面光滑，形态呈圆形（图1B）。

图1 菌株LAM2021的革兰氏染色结果与在LB平板上的菌落形态

2.2 基于16S rRNA基因序列系统发育分析

将菌株LAM2021的16S rRNA基因序列信息提交至GenBank数据库（序列登录号为MW429194），以该序列信息在EzBiocloud网站上进行序列比对，结果表明，LAM2021的16S rRNA基因序列与Kosakonia sacchari（JQ001784）相似性最高，达到99.32%；与Kosakonia pseudosacchari（FXWP01000029）的相似性是98.91%。从利用 NJ（Neighbor Joining method）法构建的系统发育树（图2）中可以看出，菌株LAM2021与来自Kosakonia属的菌株聚在一起，形成一个独立的分支，因此，初步将该菌株鉴定 为Kosakoniasp. LAM2021。Kosakonia sacchari的基因组信息在NCBI数据库中下载。通过OrthoANIu algorithm（https：//www.ezbiocloud.net/tools/ani）分 析 疑似新种菌株与相似菌株的平均核苷酸水平（ANI）可得，LAM2021的基因组序列Kosakonia sacchari的ANI值是95.79%，Kosakonia pseudosacchari的ANI值是93.84%；同时利用Genome-to-Genome Distance Calculator 2.1（http：//ggdc.dsmz.de/）对疑似新种与相似菌株间的DNA同源性（DDH）值进行计算。LAM2021的基因组序列Kosakonia sacchari的DDH值是65.30%，Kosakonia pseudosacchari的DDH值是54.10%。

图2 菌株LAM2021 的 16S rRNA 序列构建的系统发育树分析

2.3 氮源对氯嘧磺隆降解菌LAM2021降解能力的影响

将菌株LAM2021接种到不同氮源的GSM培养基中，于30℃、160 r/min条件下培养，结果见图3。当葡萄糖作为碳源时，外加氮源能够提高氯嘧磺隆的降解能力，其中氮源为硫酸铵，菌株的降解能力最强，因此氯嘧磺隆最佳的氮源是硫酸铵。

图3 不同氮源对菌株LMA2021降解能力的影响

2.4 氯嘧磺隆降解菌降解条件优化

菌株LAM2021能以氯嘧磺隆为唯一氮源进行生长，从降解的实验结果可以看出，不同氯嘧磺隆底物浓度对菌株LAM2021的降解率影响较小（图4A），而在160 r/min、pH 7.0、接种量为5%的OD600=1.0的菌株LAM2021、氯嘧磺隆底物浓度为100 mg/L的条件下，温度对菌株LAM2021的降解率影响较大（图4B），菌株在30℃时的降解率达到最大值，为92.6%；菌株在20℃中9 h内几乎不降解，说明菌株LAM2021在低温下生长较慢。在160 r/min、30℃、接种量为5%的OD600=1.0的菌株LAM2021、氯嘧磺隆底物浓度为100 mg/L的条件下，pH为5.0～9.0的范围内，降解率先增加后减少（图4C），pH为7.0的降解率在9 h达到最大值88.6%，同时9 h后pH为5.0时，菌株的降解率达到100%。

图4 不同环境因素对氯嘧磺隆降解的影响

2.5 响应面优化结果

利用Design-Expert 8.0.6，对BBD模型实验数据进行多项回归分析得到拟合模型：Y=-345.58+65.30A+13.83B+0.50978C-0.564AB-0.080AC-8.067BC-3.38A2-0.155B2-6.56C2，回归方程中，Y为菌株LAM2021氯嘧磺隆降解率；其中A为pH、B为温度、C为底物浓度。

利用Design-Expert 8.0.6分析得出菌株LAM2021对氯嘧磺隆降解率响应分析实验回归分析结果见图4D。菌株LAM2021采用响应面实验，结果显示氯嘧磺隆的最佳降解条件为：在接种量5%的基础上，30℃、pH 6.0，底物浓度50 mg/L。虽然pH为5.0时，氯嘧磺隆降解率可达100%，可以推断出氯嘧磺隆在酸性条件下可以发生水解，但是酸性条件下氯嘧磺隆以化学水解为主，而中性或偏中性有利于菌株LAM2021的生长和降解酶活性的提高。

2.6 氯嘧磺隆降解菌LAM2021产生的短链有机酸的鉴定

菌株LAM2021在含氯嘧磺隆的GSM培养基中培养，培养液体系pH在1 d之内从7.0降至3.4，由于氯嘧磺隆在酸性条件下极不稳定，推测菌株LAM2021对氯嘧磺隆的降解存在由于pH下降造成酸解的机制。利用HPLC对菌株的培养液进行了检测，发现其中有柠檬酸的产生。同时不同时间取样，发现在22 h有柠檬酸的大量累积，累积量高达750 mg/L（图5）。

图5 降解菌LAM2021在GSM培养基产生的短链有机酸

2.7 菌株LAM2021降解氯嘧磺隆代谢产物检测及其代谢途径推测

利用LC-MS检测了菌株LAM2021与氯嘧磺隆共培养1 d后的中间代谢产物。通过ESI源检测结果表明，在阴离子模式中，共检测到5个片段，质荷比分别为413.03、228.03、200、181.99、158.01 m/z。根据一级和二级质谱的结果及其氯嘧磺隆自身的结构特征，初步判定物质A是氯嘧磺隆，物质B是邻甲酸乙酯苯磺酰胺，物质C是邻甲酸苯磺酰胺，物质D是N-醛基糖精，物质E是2-氨基-4-氯-6-甲基嘧啶（图6）。

图6 降解菌LAM2021的代谢产物

氯嘧磺隆在GSM培养基中，在微生物的作用下，磺酰脲桥首先发生断裂，生成产物2-氨基-4-氯-6甲氧基嘧啶（产物E）和邻甲酸乙酯苯磺酰胺（产物B）。邻甲酸乙酯苯磺酰胺继续在微生物的代谢作用下发生水解反应，生成邻甲酸苯磺酰胺（产物C）。由于邻磺酰胺苯甲酸不稳定，发生环化反应，生成N-醛基糖精（产物D）。基于以上检测到的代谢产物，推测LAM2021降解氯嘧磺隆的代谢途径如图7所示。

图7 降解菌LAM2021的代谢途径

2.8 氯嘧磺隆降解菌的基因组信息

将菌株LAM2021的基因组信息提交至NCBI数据库（序列登录号为：JAENHT000000000），全基因组测序结果如表1所示。

表1 LAM2021的基因组组分分析

基于已报道的氯嘧磺隆降解基因信息，菌株LAM2021中有17个可能与降解相关的功能基因，包括2个羧酸酯酶基因、5个糖基转移酶基因、10个酯酶基因。

3 讨论

3.1 氯嘧磺隆的降解

长期大量施用氯嘧磺隆产生的残留会对后茬敏感作物造成一定的药害，造成产量下降，同时也会造成环境污染，还会通过食物链影响人类健康。因此探寻高效、安全、经济的除草剂污染环境治理方法十分迫切。在生态系统中，微生物对于农药的降解起着关键的作用，以微生物修复理论为基础的除草剂残留降解技术是解决土壤修复问题的有效途径［25］。目前，已报道的可降解细菌种属以假单胞菌和黄杆菌属为代表的革兰氏阴性菌占多数，这些细菌借助外壁层脂多糖保护，免受农药的毒害，对多种农药有分解作用［26］。本研究从某磺酰脲类除草剂生产厂废水处理池活性污泥中，富集驯化分离出一株氯嘧磺隆高效降解菌LAM2021，经16S rRNA基因序列比对分析，初步将该菌株鉴定为Kosakoniasp.，这是首次关于Kosakonia属菌株具有氯嘧磺隆降解功能的报道，丰富了氯嘧磺隆降解微生物资源多样性。

3.2 初探氯嘧磺隆降解菌降解氯嘧磺隆的降解机理

在已报道的氯嘧磺隆微生物降解途径与相关机制中，氯嘧磺隆主要通过脲桥断裂和酯键断裂两类反应完成降解。Ma等［12］在氯嘧磺隆的降解产物研究中发现代谢产物2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶。Zou等［27］在真菌TR-H降解氯嘧磺隆过程中发现邻磺酰苯甲酸亚胺和2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶两种产物。在本研究中，利用LC-MS共检测到4种代谢产物（邻磺酰苯甲酸亚胺、邻甲酸乙酯苯磺酰胺、邻甲酸苯磺酰胺和2-氨基-4-氯-6-甲基嘧啶）。同时监测到菌株与氯嘧磺隆共培养过程中，体系的pH从7.0减少到3.4，致使环境酸化，造成氯嘧磺隆的脲桥发生断裂［28］。HPLC检测结果表明，这是由于菌株在代谢过程中主要产生柠檬酸所致。同时该菌株中还有多个已报道的参与氯嘧磺隆降解的功能基因，如羧酸酯酶基因、细胞色素P-450基因和糖基转移酶基因等［29］，其中羧酸酯酶主要参与氯嘧磺隆的酯键断裂［30］。

4 结论

本研究从安徽合肥某磺酰脲类除草剂生产废水处理池污泥中分离获得一株高效氯嘧磺隆降解菌Kosakoniasp. LAM2021。通过RSM方法优化出该菌株的最佳降解条件为：30℃，底物浓度为50 mg/L，pH为6.0。在此条件下，降解率为94.6%。基于代谢产物初步推定了菌株降解氯嘧磺隆的降解途径；菌株代谢氯嘧磺隆过程中主要通过代谢产生柠檬酸，排出胞外致使环境酸化，造成除草剂脲桥断裂。通过菌株的全基因组信息分析，发现该菌株含有大量已报道参与氯嘧磺隆降解的功能基因。本研究从菌株降解特性、降解条件优化、代谢途径及降解相关功能基因4个层面系统探索了新分离菌株Kosakoniasp. LAM2021对氯嘧磺隆的降解特性及代谢机理，结果表明，该菌株对氯嘧磺隆具有较高的降解能力，为今后高效降解工程菌株的构建与功能菌剂的开发提供了优良的菌株。