偏痛汤1号对硝酸甘油致偏头痛模型大鼠药效学影响研究

罗亚敏 葛 飞 李伊然 周冉冉 张 瑶 李 冉 陶晓华

(北京中医药大学，北京，100029)

偏头痛是一种临床常见的原发性头痛疾病，常伴自主神经症状。其发病率较高，具有反复发作、迁延不愈的特点，好发于女性及青少年。女性发病率占非老年人2倍，其对本病敏感性更强、持续时间更长、症状表现更剧烈，尤以皮肤异常疼痛感为甚[1-2]，多个国家和地区也有相关研究显示女性偏头痛患病率为男性的2～4倍[3-4]。我国偏头痛患病率为9.3%，其中男性5.9%，女性12.8%[5]。偏头痛患者常伴中风、心房颤动、高血压等心血管疾病，出现胸痛、晕厥甚至猝死，尤以女性更甚，证明其发病程度趋于严重化及女性人群趋于敏感化[6-7]。偏痛汤1号是陶晓华教授对偏头痛理论、临床专题研究数十载及其在协定处方偏痛汤胶囊流浸膏的临床和实验探究基础上[8-16]，并针对本病“风痰互结、瘀浊内阻、清阳失布”的病机特征，于偏痛汤组方(川芎10 g、地龙10 g、僵蚕6 g、珍珠母30 g、红花10 g、鸡血藤15 g、夏枯草15 g、细辛3 g、白芍20 g、甘草6 g)中增补蔓荆子一味而成的系列抗偏头痛协定方之一，具有化痰降浊、祛瘀止痛、升清疏散的功效。本课题组前期基于UHPLC-LTQ-Orbitrap MS技术对本方化学成分信息及药效物质基础进行研究表明其抗偏头痛作用与镇痛抗炎、修复中枢敏化有关[17-18]。动物实验亦显示偏痛汤1号显著下调硝酸甘油致偏头痛模型大鼠硬脑膜、血浆CGRP蛋白表达水平及硬脑膜前列腺素E2、肿瘤坏死因子-α表达水平，从而达到抑制神经源炎性痛敏性偏头痛的作用[19]。在此基础上，本研究以大鼠体内实验为研究方法，探讨偏痛汤1号对硝酸甘油致偏头痛模型大鼠药效学影响及雌雄大鼠罹患偏头痛后的指标变化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级雄、雌性SD大鼠84只，体质量(200±10)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2016-0006。本次动物实验经北京中医药大学学术委员会实验动物伦理分委员会批准(伦理审批号:BUCM-4-2019 111901-4062)，符合动物伦理委员会的要求，并饲养于北京中医药大学实验动物中心，环境温度21～24 ℃，相对湿度60%～70%，24 h昼夜循环光环境，适应性喂养1周，进行模型制备。

1.1.2 药物 偏痛汤1号由北京中医药大学东方医院药剂科制备，临时用蒸馏水配成相应浓度的混悬液；Trpv1抑制剂-SB705498(Bioruler，美国，生产批号：r4438)；佐米曲普坦片(万特制药有限公司，国药准字H20061077)；硝酸甘油注射液(北京益民药业有限公司,国药准字H11020289)。

1.1.3 试剂与仪器 Rat 5-HT ELISA KIT(上海酶联生物科技有限公司，国药准字20201015-30019B)；Rat HIS ELISA KIT(上海酶联生物科技有限公司，国药准字20201015-31092B)；Von Frey Hairs触觉测量套件(Ugo Basile,意大利,型号：514000-20C)；酶标仪(Thermo Scientific，美国，型号：Multiskan MK3)；自动洗衣板(北京拓普分析仪器有限公司，型号：DEM-3)；电热恒温培养箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司，型号：SKP-02.600)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型制备 84只SD大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为空白组(12只)、假手术组(12只)和模型组(60只)，各组雌雄各半。模型组于大鼠颈背部皮下注射硝酸甘油10 mg/(kg·d)，2 d/次，共5次，建立偏头痛模型；假手术组颈背部皮下注射0.9%生理盐水20 μL/(kg·d)，注射次数同模型组。观察每次造模时的行为学表现，于20 min内出现前肢频繁挠头、往返运动、爬笼次数增多等现象，60 min左右上述表现达到高峰，视为造模成功[20]。

采用Oshinsky和Gomonchareonsiri[21]方法，将大鼠置于固定器中安静30 min后，测定第1次造模前1 h及前4次造模后第2天大鼠眼眶痛觉阈值。与空白组比较，假手术组眼眶痛觉阈值变化不明显，差异无统计学意义(P>0.05)，而模型组痛阈显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)；与假手术组比较，模型组显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，提示硝酸甘油触发的疼痛敏化表现明显，提示偏头痛模型大鼠造模成功。将60只成模大鼠按随机数字表分成模型组、阳性药组、TRPV1抑制剂组、偏痛汤1号组、TRPV1抑制剂+偏痛汤1号组，每组12只，雌雄各半。

1.2.2 给药方法 分组后各组大鼠给予相应药物连续灌胃7 d。空白组、假手术组和模型组每天给予等容积蒸馏水5 mL/(kg·d)，阳性药组给予0.25 mg/(kg·d)佐米曲普坦片灌胃，TRPV1抑制剂组灌胃SB705498 3 mg/(kg·d)[22]，偏痛汤1号组灌胃中药13.5 g/(kg·d)，按生药量计算，以上各组灌胃剂量均相当于临床成人用量6倍。同时在灌胃1 d、4 d、7 d时观察大鼠行为学变化及2 d、4 d、6 d时检测各组大鼠眼眶痛阈值。

1.2.3 行为学表现及观察指标 给药前30 min将大鼠置于透明玻璃观察箱内熟悉环境，给药后1 h内继续在箱内观察每组大鼠爬笼次数、抓挠头部(头皮及眶周)次数及往返运动次数，并记录观察指标：1)抓挠头部出现连续5次及以上为标志，而消失征象以1个时间段挠抓次数少于5次并出现疲劳、倦怠为基准；2)大鼠挠抓头部行为以前后肢挠抓为记录指征，爬笼行为以大鼠前后肢抓笼盖为记录指征，往返运动行为以大鼠头部向后转至尾部为记录指征。

1.2.4 Von Frey纤维丝测眼周皮肤痛觉阈值 大鼠在固定器中进行5 d适应性训练，每天15 min。实验开始时从Von Frey最小纤维丝型号开始(log值1.65，对应0.008 g)对大鼠眼眶周围皮肤进行刺激，逐渐增加至最大纤维丝型号(log值6.65，对应300 g)，每根纤维丝需刺激5次，其中出现3次及以上阳性反应，如大鼠缩头、用前爪拨开纤维丝及发声等表现时，可将大鼠阳性反应对应的log值记录为疼痛阈值。

1.2.5 样本采集 以50 mg/(kg·d)剂量腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹主动脉取血5 mL，置于抗凝真空采血管中，轻轻摇匀，4 ℃，3 000 r/min，离心10 min，分离血浆，-20 ℃保存，用酶联免疫吸附试验法检测。

1.2.6 各组大鼠外周血浆中5-羟色胺、组胺蛋白含量测定 运用ELISA技术检测，依照试剂盒说明书，对外周血浆组胺、5-羟色胺进行检测和分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，当每组数据符合正态分布时，组间比较采用One-way ANOVA法。若方差齐性，组间差异比较采用LSD法；若方差不齐性，组间差异比较采用Tamhane法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 颈背部皮下注射硝酸甘油会诱导偏头痛样行为和眼眶皮肤痛敏反应 与空白组比较，模型组大鼠每次造模后挠头及往返运动等偏头痛样行为评分均显著上升，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，而爬笼行为仅于第2次造模后评分显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)；假手术组大鼠每次造模后挠头、爬笼、往返运动等偏头痛样行为评分与模型组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。与假手术组比较，模型组大鼠每次造模后挠头行为评分均显著提高，差异有统计学意义(P<0.01)，往返运动评分在1 T、2 T、3 T、5 T造模后的差异均有统计学意义(均P<0.01)；2组大鼠每次造模后爬笼行为评分比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见图1A～1C。

如图1D所示，第1次造模前1 h 3组大鼠基础疼痛阈值比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。模型组大鼠在前4次造模后第2天眼眶痛觉阈值均下降，与空白组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)；假手术组大鼠前4次造模后眼眶痛觉阈值差异均无统计学意义(均P>0.05)。模型组大鼠前4次造模后眼眶痛觉阈值均呈显著下调，与假手术组比较差异均有统计学意义(均P<0.01)。故根据以上结果显示皮下多次注射硝酸甘油会诱导偏头痛样行为，且引起模型大鼠敏化性痛觉反应，提示从行为学角度痛敏性偏头痛模型造模成功。

图1 造模后偏头痛样行为及眼眶皮肤超敏反应变化

2.2 偏痛汤1号对硝酸甘油诱导的偏头痛样行为及眼眶皮肤痛敏反应影响 大鼠灌胃后各组行为学评分如图2A～2C所示。与空白组比较，模型组大鼠灌胃第1天、第4天、第7天挠头及往返运动评分显著提高，差异均有统计学意义(均P<0.05，P<0.01)，爬笼评分于灌胃第7天显著下降(P<0.01)，表明硝酸甘油造模成功后爬笼行为会因大鼠出现偏头痛样疲倦而降低。与假手术组比较，模型组大鼠亦表现为挠头显著性上升，而往返运动评分仅在第4天及第7天明显增加差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。与模型组比较，阳性药组大鼠灌胃第4天、第7天挠头行为学评分显著性下调，灌胃第1天往返运动评分显著下降，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；TRPV1抑制剂组、偏痛汤1号组、TRPV1抑制剂+偏痛汤1号组挠头评分明显下降，而往返运动于灌胃第1天见偏痛汤1号组显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，其余时间偏痛汤1号组下降趋势均较其余组下降明显，表示偏痛汤1号组对偏头痛样行为抑制效果较佳。

如图2-D所示，与空白组及假手术组比较，模型组大鼠灌胃第2天、第4天、第6天疼痛阈值显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.01)。而与模型组比较，阳性药组及TRPV1抑制剂组大鼠灌胃第2天、第4天眼眶疼痛阈值显著上升，差异均有统计学意义(均P<0.01)，TRPV1抑制剂+偏痛汤1号组大鼠灌胃第2天、第6天疼痛阈值明显上调，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，偏痛汤1号组大鼠灌胃第2天、第4天、第6天眼眶痛敏阈值显著性升高，差异均有统计学意义(均P<0.05，P<0.01)。与阳性药组比较，TRPV1抑制剂+偏痛汤1号组大鼠灌胃第4天痛敏反应较为显著，差异有统计学意义(P<0.05)，而与TRPV1抑制剂组比较，偏痛汤1号组灌胃第6天痛敏反应下降，差异有统计学意义(P<0.05)，表明偏痛汤1号组上调疼痛阈值，抑制痛敏性偏头痛效果最为明显。

图2 灌胃后偏头痛样行为及眼眶皮肤超敏反应变化

2.3 偏痛汤1号对外周血浆5-羟色胺、组胺蛋白表达水平影响 如图3所示，假手术组大鼠血浆5-羟色胺、组胺蛋白表达与空白组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；而模型组大鼠组胺蛋白含量显著上调，5-羟色胺蛋白含量显著下调，与空白组比较差异均有统计学意义(均P<0.05，P<0.01)。模型组大鼠组胺蛋白表达水平显著上升，与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.01)；表明作为偏头痛发作的标志性物质血管活性胺浓度变化显示本次偏头痛模型造模成功。与模型组比较，阳性药组、偏痛汤1号组大鼠血浆组胺蛋白表达均显著性下调，差异均有统计学意义(均P<0.01)；而除TRPV1抑制剂组外，其余组大鼠血浆中5-羟色胺蛋白表达水平均显著上调，差异均有统计学意义(均P<0.05，P<0.01)，表示偏痛汤1号对偏头痛标志性蛋白显示改善作用。

图3 各组大鼠血浆5-羟色胺、组胺蛋白表达水平变化

2.4 雌雄大鼠偏头痛样行为评分及痛敏反应阈值比较 偏头痛发作时间、疼痛敏感、强度与性别关联密切，故根据实验数据结果进一步分析雌雄大鼠偏头痛样行为评分及痛敏反应的差异。如图4所示，与雌性-模型组比较，雄性-模型组在1 T造模后挠头评分显著下调，差异有统计学意义(P<0.01)，爬笼行为学评分在3 T造模后显著下降，差异有统计学意义(P<0.01)，往返运动行为学评分在2T、3T、4T、5T造模后均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，且前4次造模后第2天眼眶痛觉阈值均呈下降趋势，但差异均无统计学意义(均P>0.05)。

图4 模型组雌雄大鼠偏头痛样行为学评分及痛阈值比较

如图5所示，与雌性-偏痛汤1号组比较，雄性-偏痛汤1号组灌胃第1天、第4天、第7天挠头行为学评分呈下降趋势，爬笼评分在第4天显著下调，差异有统计学意义(P<0.05)，至第7天差异无统计学意义(P>0.05)，疼痛阈值在第2天、第4天显著降低，而在第6天明显上升，差异均有统计学意义(均P<0.05，P<0.01)。

图5 偏痛汤1号组雌雄大鼠偏头痛样行为学及痛阈值差异比较

以上结果显示，模型组雌雄大鼠挠头、爬笼行为评分及痛敏反应差异趋势较小，往返运动行为评分差异显著，经灌胃治疗后，雄性大鼠挠头现象下降趋势较为明显，而爬笼、往返运动等偏头痛样行为评分下调趋势与雌性大鼠差别不大，疼痛阈值显著上升，推测偏头痛发作时雌性大鼠烦躁不安表现明显，疼痛耐受感表现较强烈，用药后疗效较雄性大鼠差，耐药性较高。

2.5 雌雄大鼠外周血浆5-羟色胺、组胺蛋白水平比较 如图6所示，与雌性-模型组比较，雄性-模型组外周血浆组胺蛋白表达水平显著上升，差异有统计学意义(P<0.01)。与雌性-偏痛汤1号组比较，雄性-偏痛汤1号组组胺蛋白表达显著上升，差异有统计学意义(P<0.01)。与雌性大鼠比较，推测偏头痛发作时雄性大鼠组胺表达上升显著，5-羟色胺表达亦有上调趋势，而经药物治疗后组胺、5-羟色胺表达变化趋势不甚明显，具体因素需进一步通过代谢组学研究其机制差异。

图6 模型组、偏痛汤1号组雌雄大鼠5-羟色胺、组胺蛋白表达水平比较

3 讨论

偏头痛发病机制复杂多端，致使基础研究缺乏完整复制本病的动物模型。而硝酸甘油转化的偏头痛模型对本病特点还原度较高，其可诱发“头痛持续发作4～72 h、搏动样表现、恶心和/或呕吐、异常性疼痛”等症状，符合国际头痛协会偏头痛的诊断标准[23]，且研究表明偏头痛患者静脉注射一氧化氮供体硝酸甘油可诱发偏头痛样头痛发作[24]。一氧化氮通过肥大细胞脱颗粒介导血管活性胺变化、神经源性炎症闭环级联反应、神经肽及神经营养因子变化等途径参与三叉神经血管系统(Trigeminovascular System，TGVS)的致敏和激活[26-28]，并增加三叉神经节神经元和神经胶质细胞的敏感性和兴奋性，致使本病反复发作、迁延难愈。有报道经硝酸甘油处理制备的偏头痛动物模型广泛应用于偏头痛的基础研究，均证实了硝酸甘油不仅触发偏头痛样头痛，且诱导模型动物产生痛觉过敏[29-31]。在此次研究中，基于硝酸甘油建立大鼠偏头痛模型以探索模型有效性及偏痛汤1号药效学作用。实验结果显示，颈背部皮下注射硝酸甘油会导致模型大鼠偏头痛样行为及敏化痛觉反应，与文献记载该模型的研究结果相似[32-33]。而偏痛汤1号可缓解大鼠偏头痛样行为及痛敏反应，表明偏痛汤1号可通过改善偏头痛大鼠行为学及疼痛阈值治疗偏头痛。

5-羟色胺是一种在脑内保护神经元免受“兴奋神经毒素”损害的单胺抑制类神经递质，在外周促进血管收缩、血液凝固的血管收缩因子[34]。已有临床研究证明静脉滴注5-羟色胺可抑制自发性偏头痛发作[35]。临床及动物实验研究亦提出血浆和脑中5-羟色胺低表达间接增加TGVS敏感性，可导致偏头痛的反复发作[36-38]，且在本病发作期间尿液中5-羟色胺代谢物增加[39]，表明血浆5-羟色胺低表达在偏头痛发作中起重要作用。本实验结果显示模型组大鼠血浆5-羟色胺表达显著下调，与以上文献研究结果一致，而中药复方偏痛汤1号可显著上调血浆5-羟色胺表达水平，说明偏痛汤1号可通过促进5-羟色胺高表达而抑制偏头痛发作。

组胺是一种由嗜碱性球和附近结缔组织肥大细胞产生的含氮生物胺，其参与局部免疫反应和炎症反应，亦是一种重要的神经递质[40]。在偏头痛发作期间血浆组胺水平显著升高，且静脉滴注组胺会促进偏头痛样头痛[41-42]。实验研究表明组胺能够刺激小胶质细胞释放炎症介质[43]。在偏头痛发作期间，通过TGVS激活导致肥大细胞脱颗粒释放组胺引起离子通道及炎症闭环级联反应，维持神经源性炎症及中枢敏化特征，表明组胺在偏头痛的发病机制中起着至关重要的作用[44]。本实验结果亦显示，模型组大鼠血浆组胺表达显著上升，与以上文献结果阐述一致，且偏痛汤1号对血浆组胺表达显著下调，证明偏痛汤1号方可通过抑制组胺所造成的神经源性炎症状态而治疗偏头痛。

硝酸甘油诱导的偏头痛模型大鼠脑内神经元激活存在性别差异[45]，表明性别是导致偏头痛发病率差异的重要因素，其可能与雌激素通过脑神经营养因子及细胞外信号调节激酶途径促进中枢致敏有关。在硝酸甘油触发的偏头痛模型中，雌性大小鼠对机械性痛觉过敏感觉更为强烈，其会出现延迟发作的现象，同时在后爪皮内注射硝酸甘油亦导致雌性大鼠痛觉反应更为敏感[46]。本实验结果显示，模型组雌雄大鼠挠头、爬笼行为、痛敏反应及5-羟色胺表达差异趋势较小，往返运动行为评分及组胺表达差异显著，经灌胃治疗后，雄性大鼠挠头现象下降趋势较为明显，而爬笼、往返运动等评分下调趋势与雌性大鼠差别不大，疼痛阈值显著上升，5-羟色胺、组胺表达下调趋势不甚明显，具体需进一步以代谢组学方法评估性别特征在本病中发病率的差异。

偏痛汤1号以川芎、蔓荆子为君，善活血行气、祛风止痛，协同为用。地龙、僵蚕、珍珠母、夏枯草、红花、鸡血藤共为臣药，化痰降浊、祛瘀止痛。细辛，入阴经，引药上行。白芍、甘草，取甘酸化阴、缓急止痛之意，共为佐使。全方配伍，刚柔相济，升降有常，主辅有序，针对本病风痰互结、瘀浊内阻、清阳失布的核心病机，有效改善偏头痛反复发作的特性。现代药理研究认为，川芎含生物碱川芎嗪，能通过血脑屏障，可通过影响单胺类递质的释放，缓解神经源炎症而改善偏头痛[47]。蔓荆子、夏枯草、细辛、白芍均有不同程度的镇痛、抗炎作用[48-51]。鸡血藤、红花均具有抗凝、改善微循环作用[52-54]，提示本方可以通过多途径-多方向发挥抗偏头痛疗效，而具体分子生物学机制需进一步研究。

4 结论

偏头痛是脑内多区域、多途径、多机制相互作用形成的一种复杂疾病。在过去几十年中，基于硝酸甘油处理制备的临床及动物模型为偏头痛潜在发病因素研究做出了重要贡献。故进一步以本模型研究偏头痛不仅能预测潜在药物靶标，还将为本病发病原因及其内在分子生物学机制探索提供新线索。本研究结果亦显示，硝酸甘油在诱导偏头痛样行为及痛敏反应上的作用，并深入以血浆血管活性胺水平变化表明模型的有效性。而经硝酸甘油诱导的偏头痛经偏痛汤1号干预后均有不同程度的改善，证明偏痛汤1号方剂具有抗偏头痛的作用，具体分子生物学机制需要进一步探究。此外，本研究还基于以上数据结果分析了性别特征在偏头痛中的差异，但如何引起雌雄大鼠在偏头痛发生率中的差异还需运用代谢组学方法深入研究。