基于顶空固相微萃取-气相色谱-飞行时间质谱联用技术分析固样方法对茶叶挥发性成分的影响

李炫烨，陈思，刘毓婕，陈亮，俞晓敏，马建强*

1(中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州，310008)2(中国农业科学院研究生院，北京，100081)3(福建农林大学园艺植物生物学及代谢组学研究中心，福建 福州，350002)

香气是衡量茶叶质量的重要指标之一，GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》中显示，香气因子占综合得分25%以上。茶叶中的挥发性成分，例如香叶醇、芳樟醇等萜类及衍生物，苯甲醇、苯乙醇等芳香族类化合物，以及水杨酸甲酯、己酸叶醇酯等脂肪酸衍生物等，大多具有较好的香型和较低的阈值，对茶叶香气风味的形成具有重要作用[1]。但是这些挥发性成分在茶叶样品制备过程中易受影响，因此选择合适的固样方法对于开展茶叶香气研究至关重要。

目前测定茶叶品质成分常用的固样方法包括热风固样(hot-air drying,HA)、微波固样(microwave drying,MW)和真空冷冻固样(vacuum freeze drying,VF) 等[2-3]。项丽慧等[4]比较了真空冷冻、微波和热风固样对茶多酚、游离氨基酸和咖啡碱等物质含量的影响，认为微波固样具有较好的简便性、保真性和节能性。朱善良[5]的研究表明，微波杀青+烘干的固样方法更适用于鲜叶生化成分的检测。龚志华等[6]比较了6种固样方法对茶多酚、蛋白质、可溶性糖等成分的影响，发现真空冷冻固样的效果最好。但上述研究都是针对非挥发性成分，而固样方法对茶叶挥发性成分的影响鲜有报道[7]。

本研究以‘黄旦(HS)’、‘黄奇(HQ)’、‘福鼎大白茶(FD)’和‘尖波黄13号(JBH)’等4个茶树品种鲜叶为供试材料，采用顶空固相微萃取(headspace-solid phase microextraction，HS-SPME)结合气相色谱-飞行时间质谱技术(gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC-TOF-MS)，对真空冷冻、微波和热风等3种固样方法处理的茶叶样品以及绿茶样品进行挥发性成分分析，为开展茶叶香气成分批量检测和高香茶树品种选育等工作提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

茶树鲜叶原料来源于浙江省杭州市国家茶树种质资源圃，2020年10月采摘‘黄旦’、‘黄奇’、‘福鼎大白茶’、和‘尖波黄13号’等4个品种的一芽二叶新稍，使用真空冷冻、微波和热风等3种固样方法以及烘青绿茶(green tea,GT)工艺制成茶叶样品。

1.2 仪器与设备

FD8-3P-GOLD-SIM冻干机，金西盟(北京)仪器有限公司；7890B气相色谱，美国安捷伦公司；Pegasus HT飞行时间质谱，美国力可公司，G70F23 N1P微波炉，广东格兰仕集团有限公司；CHM-901型电热式碧螺春烘干机，浙江春江茶叶机械有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 固样方法

真空冷冻固样：鲜叶置于液氮速冻后，使用冻干机在-70 ℃和10 mTorr条件下真空冷冻处理48 h。微波固样：鲜叶使用微波炉在800 W条件下微波处理7 min。热风固样：鲜叶使用碧螺春烘干机120 ℃初烘14 min，然后80 ℃烘至足干。绿茶样品：鲜叶经摊放(5 h)、杀青(220～280 ℃，1.5～2 min)、揉捻、干燥(初烘120 ℃，复烘80 ℃)等工序制成绿茶样品。样品名称及编号见表1，每个样品设置3个生物学重复。

表1 样品名称及编号Table 1 Sample names and codes

1.3.2 挥发性成分提取与检测

将茶叶样品研钵成均匀粉末，称取1.5 g置于20 mL 顶空瓶中，参考CHEN等[8]方法采用HS-SPME提取挥发性成分，然后使用GC-TOF-MS进行检测。同时每个样品取等量进行混合，制成质量控制样品，在数据采集时每隔5个茶叶样品加入1个质量控制样品，以检测仪器的稳定性。

SPME条件：萃取针PDMS/DVB(美国Supelco公司)，孵化温度80 ℃，孵化时间30 min，萃取时间30 min，解吸附时间5 min。GC-TOF-MS条件：色谱柱Restek Rxi-5Sil MS capillary column(30 m×0.25 mm×0.25 μm film thickness)，进样口温度250 ℃，传输线温度275 ℃；载气为氦气，流速1.5 mL/min；程序升温为：50 ℃保持5 min，3 ℃/min升至210 ℃保持3 min，15 ℃升至230 ℃保持5 min；不分流进样；溶剂延迟200 s，扫描范围30～500 AMU，采集速率10谱图/s，检测器电压1 570 V，EI电离能量 -70 eV，离子源温度250 ℃。

1.4 数据处理

将质谱数据导入ChromaTof软件(version 4.51.6，美国LECO公司)，经解卷积、峰对齐后得到挥发性成分的峰面积。根据保留时间和质谱信息，利用标准样品和NIST 2014(National Institute of Standards and Technology)数据库的标准质谱图进行化合物鉴定，以3次生物学重复的平均峰面积代表相对含量。采用SIMCA-P 14.0软件进行主成分分析(principal component analysis，PCA)，使用‘悟空’在线分析平台(https://www.omicsolution.com/wkomics/main/)绘制韦恩图和热图，利用SPSS 18(美国IBM公司)进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 PCA和相关性分析

全部样品共检测到1 085个峰，经过数据过滤(剔除质量控制样品RSD>30%的峰)，共得到341个化合物，导入SIMCA-P 14.0软件进行PCA。结果显示，不同固样方法的样品可以被很好地区分开，而在相同的固样方法样品组中，4个品种样品间的差异则相对较小。由PCA得分图可见，PC1(第一主成分)贡献率为46.4%，PC2(第二主成分)贡献率为17.7%(图1)，其中真空冷冻样品明显区别于其他3组样品，微波、热风和绿茶样品仅在PC2方向上呈现出一定的分离趋势，而热风和绿茶样品的差异性相对较小。

图1 四个茶树品种不同固样方法和绿茶样品的挥发性成分PCA分析Fig.1 PCA analysis of total volatiles of green tea and tea leaf samples of four cultivars derived from different drying methods

皮尔逊相关性分析与PCA分析结果类似：相同固样方法处理的样品，其挥发性成分的相似性系数最高，而同一品种中的真空冷冻样品与其他3种样品的相似性系数最低，并且绿茶样品与热风样品的相似性高于微波样品(图2)。上述结果表明，固样方法会对茶叶的挥发性成分造成较大影响，真空冷冻样品明显区别于微波、热风和绿茶样品，同时热风和绿茶样品比较相似。

图2 四个茶树品种不同固样方法和绿茶样品的挥发性成分相关性分析Fig.2 Correlation analysis of total volatiles of green tea and tea leaf samples of four cultivars derived from different drying methods

2.2 挥发性成分的定性分析

根据化合物保留时间及质谱信息，通过标准样品信息比对和NIST数据库检索，共鉴定出95种挥发性成分(附表)，按照化合物类型大致可分为七大类(图3-A)，其中酯类化合物数量最多，共26种，占比27%，随后依次为烯类18种(19%)、醇类13种(14%)、醛类11种(12%)、酮类9种(9%)、吡咯类及其衍生物6种(6%)，以及其他化合物12种(13%)。

全部样品中检测到的共有挥发性成分有44种(附表)，以烯类(27%)最多，其后为醇类(20%)、酯类(16%)、酮类(14%)、醛类(14%)、吡咯类及其衍生物(2%)、以及其他化合物(7%)(图3-B)。其中相对含量较多的挥发性成分包括：香叶醇、芳香醇及其氧化物、苯甲醇、苯乙醇、柠檬烯、青叶醇、β-罗勒烯、正己醇、丁酸叶醇酯、水杨酸甲酯、己酸叶醇酯、β-紫罗酮、橙花叔醇、α-法呢烯等。这些化合物大多是茶叶的重要香气成分，这与前人的研究结果基本一致[9-10]。

A-95个挥发性成分；B-44个共有挥发性成分图3 鉴定出的95个挥发性成分和44个共有挥发性成分的类别和数量百分比Fig.3 Types and percentages of 95 volatiles detected in all samples and 44 common volatiles in each sample

2.3 不同固样方法茶叶的挥发性成分比较

分析4个品种不同固样方法样品的挥发性成分种类差异，结果如图4所示。‘黄旦’品种真空冷冻、微波、热风和绿茶样品的挥发性成分分别为73、72、70和67种，‘黄奇’为71、71、73和70种、‘福鼎大白茶’ 为80、68、67和70种，‘尖波黄13号’为79、62、66和69种。从数量上看，真空冷冻样品检测到的挥发性成分相对较多，而热风、微波与绿茶样品大致相当。同时，真空冷冻样品含有较多的特异挥发性成分，主要包括甲酸叶醇酯、己酸乙酯、水杨酸乙酯等酯类化合物；其次为微波样品，主要包括2-乙酰基吡咯、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪等吡咯类及其衍生物；而热风和绿茶样品中的特异挥发性成分相对较少。

将鉴定到的95种挥发性成分进行聚类分析，结果划分为三个大类(图5)。Cluster 1主要包括乙酸叶醇酯、香叶醇、苯乙醇、水杨酸甲酯以及芳樟醇及其氧化物等31个化合物，这些成分大都在真空冷冻样品组中含量较高。Cluster 2包含29个化合物，其中2,2,6-三甲基环己酮、β-环柠檬醛、(-)-α-古芸烯、柠檬烯、丁酸丁酯、二氢猕猴桃内酯在热风样品组中含量较高；而水杨酸-2-乙基己酯、2-甲基四氢呋喃-3-酮、三乙酸甘油酯、棕榈酸甲酯、二甲基苄基原醇、对薄荷烷在微波样品组中含量较高。Cluster 3主要包括茉莉酮、α-法呢烯、橙花叔醇、2-甲基丁酸己酯、己酸叶醇酯、β-丁香烯、β-罗勒烯等35个化合物，其含量大都在绿茶样品组中较高。

图5 鉴定到的95种挥发性成分聚类热图Fig.5 The cluster heat map of 95 volatiles

以每个品种的绿茶样品为对照，分析不同固样处理对15个已知的绿茶重要香气成分[11]含量的影响(表2)，结果发现4个品种的整体变化趋势基本一致，真空冷冻样品的香叶醇、芳樟醇、芳樟醇氧化物Ⅰ、乙酸叶醇酯、水杨酸甲酯、正己醇、β-紫罗酮、青叶醇、柠檬烯、苯乙醇等10个挥发性成分含量均高于绿茶样品；同时，热风和微波样品的香叶醇、芳樟醇、芳樟醇氧化物Ⅰ、水杨酸甲酯、青叶醇、苯乙醇、芳樟醇氧化物Ⅱ、丁酸叶醇酯、α-法呢烯、β-罗勒烯等10个挥发性成分含量均低于绿茶样品。上述结果进一步表明固样方法对茶叶的挥发性成分具有显著影响，真空冷冻固样能较好地保留大多数重要的挥发性成分，而微波和热风固样可能导致挥发性成分种类减少和含量大幅变化。

表2 不同固样方法和绿茶样品的主要挥发性成分相对含量比较Table 2 Relative content ratios of main volatiles of green tea and tea leaf samples derived from different drying methods

3 讨论

香气是茶叶风味的重要组成部分。近年来高香茶树品种选育成为茶树遗传育种研究的重要方向，但茶叶香气的影响因素复杂，研究难度较大。准确测定茶叶中的挥发性成分对于开展茶树种质资源和育种材料的香气成分鉴定和育种潜力评价等工作至关重要。样品固定是挥发性成分检测的重要步骤，本研究利用HS-SPME/GC-TOF-MS技术对4个代表性茶树品种3种固样方法及绿茶样品的挥发性成分进行分析，以评估固样方法对茶叶挥发性成分组成的影响。研究结果表明不同固样方法会导致茶叶的挥发性成分种类和含量呈现明显差异。CHEN等[12]研究发现茶鲜叶中超过20%的挥发性成分在其成品茶叶中低于检测阈值。本研究中在真空冷冻样品中检测到一些特异的挥发性成分，主要是酯类化合物，例如甲酸叶醇酯、己酸乙酯等，推测可能是在微波、热风处理和绿茶加工时，这些化合物因受热挥发或转化而大量损失。同时，大部分重要的香气成分，例如香叶醇、苯乙醇、芳樟醇及其氧化物等，其含量在微波、热风和绿茶样品中比真空冷冻样品相对较低，这与绿茶加工工艺相关研究的结果一致[13]。

本研究中的真空冷冻固样方法是在茶鲜叶采摘后立即使用液氮处理以抑制生物酶活性,然后在真空超低温条件下通过直接升华方式脱去水分，理论上可以较好地保留茶鲜叶中的内源挥发性成分[14-15]。CHEN等[16]比较了茶鲜叶、液氮保存茶鲜叶、以及真空冷冻干燥茶鲜叶的挥发性成分差异，发现真空冷冻干燥处理仍会对挥发性成分组成产生一定影响，其原因可能是在冷冻干燥过程中，一些高挥发性化合物大量损失，以及极少量的物质代谢形成新的化合物。但是在茶树遗传育种研究中往往需要进行大批量的样品分析，如果直接对茶鲜叶或液氮保存茶鲜叶进行挥发性成分测定，因样品中仍存在大量水分，在样品保存和前处理方面较为复杂，影响检测效率。从本研究结果来看，真空冷冻固样保留了较多的内源挥发性成分，能相对真实地反映茶鲜叶中的挥发性成分组成，因此可作为大批量茶鲜叶内源挥发性成分研究时较优的固样方法。

热物理化学作用是影响茶叶香气成分的重要因素[17-18]。茶叶在高温烘焙过程中氨基和羰基化合物能通过美拉德反应能形成吡咯类、吡嗪类等杂环化合物[19]。由于茶鲜叶中水分分布不均，在微波固样时局部过热，这可能是本研究中微波样品含有较多特异吡咯类及其衍生物的原因。此外，茶鲜叶采后的酶促反应是另一个影响茶叶香气成分的重要因素，通过萜类合成代谢和β-亚麻酸代谢能促进萜类和脂肪酸衍生物香气成分的增加[17]。本研究中绿茶样品的摊放工序可能是导致其β-罗勒烯、β-丁香烯、β-荜澄茄烯、丁酸叶醇酯、己酸叶醇酯等挥发性成分含量高于其他样品的原因，这与WANG等[20]研究结果基本一致。从整体来看，热风固样和绿茶样品的挥发性成分组分是较为相似的。在育种工作中，通常需要耗费大量精力制作茶样才能进行香气评价，并且一些稀有种质资源或单株材料，由于鲜叶量有限，制作茶样较难。因此针对上述情况，可以考虑使用热风固样进行鲜叶快速处理和香气成分鉴定，作为筛选高香绿茶育种材料的初步依据。

对比本研究中的4个品种样品，发现香叶醇、青叶醇、乙酸叶醇酯、苯甲醇、芳樟醇及其氧化物等是共有的主要挥发性成分，但其含量在不同品种中差异较大，这与前人的研究大体一致[21-22]。2个乌龙茶品种‘黄旦’和‘黄奇’相同固样方法处理的样品，其挥发性成分组分较为相似，且萜类化合物含量都较高。其原因可能与它们的亲缘关系较近有关，‘黄奇’ 是由‘黄旦’与‘白奇兰’的自然杂交后代选育而来，而挥发性萜类化合物是乌龙茶品种的核心香气组分[23]。WANG等[24]通过对‘黄旦’和2个绿茶品种的比较基因组学研究，发现萜类合成酶家族基因的扩增和特异性高表达是‘黄旦’高香气特征的分子基础。

综上所述，真空冷冻、微波和热风固样方法会导致茶叶挥发性成分发生不同变化，本研究认为在针对大批量茶鲜叶的挥发性成分分析时真空冷冻可能是普遍适宜的固样方法，而在育种研究中，热风固样可作为育种材料挥发性成分快速鉴定和香气潜力评估的辅助方法。值得注意的是，本研究中的热风固样方法是参考常规的生化茶叶样品制作方法，未来可以有针对性地开展系统深入研究进行进一步优化。