新疆孜然不同种类提取物的体外抗氧化 活性分析

◎ 高 萌，张世钰，任晓镤

（1.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300；2.塔里木大学 食品科学与工程学院，新疆 阿拉尔 843300）

孜然（Cuminum cyminumL.），又名孜然芹、安息茴香等，属伞形目，具有强烈特有的辛香。孜然目前在我国种植地区主要分布在新疆、内蒙古、甘肃等地，新疆目前播种面积已近200 km2，主要分布在吐鲁番、库车、沙雅等地区。孜然不仅是传统香辛料，还因其活性成分丰富，所以具有抗氧化、抗菌等功效，在传统医学中被用于治疗低血脂症和糖尿病等[1-3]。然而，目前孜然的利用仍以粗加工制品为主，未能充分利用其丰富的活性成分，造成较大浪费。国内外多位学者已经对部分地区的孜然中有效成分的提取方法、活性成分分析鉴定及其抗氧化活性等开展了相关研究，但是截至目前，对于新疆产孜然的相关研究较少，也未对孜然不同种类提取物的抗氧化活性进行对比分析。本研究以新疆产孜然为研究对象，借助超声波辅助提取技术和超临界CO2提取技术分别制备孜然水提物、醇提物和精油，对不同种类提取物中的总多酚、总黄酮的含量进行定量分析，对比分析不同种类提取物的自由基清除活性和对金属离子的还原能力，明确不同提取物的抗氧化活性，从而进一步开发孜然深加工产品，提高孜然附加值，为新疆优质孜然资源走向国内外市场提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

孜然果实，购于新疆阿拉尔市市场（新疆产孜然）；福林酚，北京索莱宝科技有限公司；1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH），美国Sigma 公司；2,2’-联氮双 （3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS），上海源叶生物科技有限公司；其他试验相关试剂均为国产分析纯。

CTXG-10B 超声循环提取机，北京弘祥隆生物技术开发公司；Lab-1C-80 真空冷冻干燥机，上海坤诚科学仪器有限公司；RE-3000 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器有限公司；Spe-ed SFE-2 型超临界萃取装置，美国ASI 公司；Synergy H1 多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司北京代表；UV-2450 紫外分光光度计，日本岛津公司；LE203E 电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；EMS-20水浴锅，常州诺基仪器有限公司；TGL-20B 高速离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 孜然不同种类提取物的制备

孜然水提物、醇提物的制备参考薛文君等[4]的方法并修改；孜然精油的制备参照沙拉买提·托乎提等[5]萃取孜然精油的最佳工艺条件并修改。

1.2.2 孜然不同种类提取物中总多酚、总黄酮含量的测定

总多酚含量的测定采用Folin-Ciocateu 比色法[6]；总黄酮含量的测定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法[7]。

1.2.3 孜然不同种类提取物体外抗氧化活性测定

本研究以DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、羟自由基清除能力和还原能力这4 项指标对孜然不同种类提取物的体外抗氧化活性进行分析。不 同提 取物 浓 度设 置 为0 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、 1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、4.0 mg·mL-1、6.0 mg·mL-1、 8.0 mg·mL-1以及10.0 mg·mL-1，以抗坏血酸作为对照进行试验，每次试验重复3 次。

孜然不同提取物对DPPH 自由基清除能力的测定参照CHEN 等[8]方法，对ABTS 自由基清除能力的测定参照LIANG 等[9]的方法并修改，对羟自由基清除能力的测定参照赵园园[10]的方法并修改，还原力的测定参照YE 等[11]的方法并修改。

1.3 数据处理

所有实验数据平行测定3 次，结果表示为平均值± 标准差，采用SPSS 26.0 软件对实验数据进行相关性分析、方差分析，显著水平为P＜0.05；用OriginPro 2021 绘图。

2 结果与分析

2.1 孜然不同种类提取物中总多酚、总黄酮含量

孜然不同提取物中活性成分含量如表1 所示，孜然醇提物的总多酚、总黄酮含量显著高于孜然水提物（P＜0.05），其中孜然醇提物的总多酚含量为 20.29 mg·g-1，总黄酮含量为2.94 mg·g-1。本研究中醇提物的总多酚含量与孙云鹏等[12]研究盛花期的新疆孜然总多酚含量20.56 mg·g-1基本一致；高于SHAN等[13]研究发现土耳其的孜然甲醇提取物中总多酚含量 2.3 mg·g-1；而REBEY 等[14]研究发现突尼斯孜然花、根提取物的总黄酮含量分别为5.6 mg·g-1和0.4 mg·g-1。以上所测得总多酚、总黄酮含量的不同可能归因于研究中所使用孜然的部位、生长条件、提取溶剂和方法等有所差异。

表1 孜然不同种类提取物中总多酚、总黄酮含量表

2.2 孜然不同种类提取物清除DPPH 自由基的能力

DPPH 自由基清除能力被广泛用于表征天然植物提取物的体外抗氧化活性[15]。由图1 可以看出，随着3种孜然提取物浓度的增加，其对DPPH 自由基的清除能力逐渐增强。当提取物的浓度低于2 mg·mL-1时，孜然水提物的清除活性相对较强，显著高于醇提物和孜然精油（P＜0.05）；而当提取物浓度高于4 mg·mL-1时，孜然醇提物对DPPH 自由基的清除活性则显著高于水提物和孜然精油（P＜0.05）。浓度为2 mg·mL-1的醇提物清除率与赵旭等[16]研究发现新疆产孜然醇提物对DPPH 自由基清除率（46.53%）相近，但均低于该浓度条件下孜然水提物的清除率，这可能是由于不同种类提取物中成分差异所致。在浓度低于2 mg·mL-1时水提物抗氧化活性强于醇提物的原因可能是水提物中的某些活性化合物在较低浓度时对DPPH 自由基的清除活性较强所致，随着浓度增加，醇提物由于其总多酚、总黄酮含量高于水提物，较高含量的有效活性成分使其对DPPH 自由基的清除能力更强。

图1 孜然不同种类提取物对DPPH 自由基的清除能力图

在浓度为10 mg·mL-1时，孜然水提物、醇提物和精油对DPPH 自由基的清除率分别为（82.59±1.10）%、（94.40±0.62）%和（75.27±1.26）%，孜然水提物、醇提物、精油对DPPH 自由基清除活性的IC50值分别 为0.48 mg·mL-1、1.78 mg·mL-1，4.38 mg·mL-1，这与王强等[17]研究得出的新疆孜然醇提物的IC50值为 1.07 mg·mL-1和HOSSEINI[18]研究发现伊朗不同地区的孜然油对DPPH 自由基清除率为96.24%的结果一致，但却远低于CHEN[19]研究的孜然精油的IC50值 35.94 mg·mL-1。这可能是由于孜然种植环境条件等原因导致不同孜然提取物中抗氧化活性成分存在较大差异所致。

2.3 孜然不同种类提取物清除ABTS 自由基的能力

从图2 可知，3种孜然提取物对ABTS 自由基均具有清除效果，随着浓度的增加，其对ABTS 自由基的清除能力逐渐增强。在所选浓度范围内，醇提物对ABTS 自由基的清除能力显著高于水提物和精油（P＜0.05），由于DPPH 和ABTS 的自由基清除试验反应原理和条件不同，醇提物对于两种自由基的清除活性不一致。在浓度为10 mg·mL-1时，醇提物对ABTS 自由基的清除率高达（92.52±1.94）%，而水提物和精油对ABTS 自由基的清除率则分别为（85.34%±0.89）%和（73.59±1.07）%；孜然醇提物、水提物、精油对ABTS 自由基清除活性的IC50值分别为0.24 mg·mL-1、0.48 mg·mL-1和2.75 mg·mL-1，这与MAHNASHI 等[20]研究发现孜然精油对ABTS 自由基的IC50值为2.71 mg·mL-1的结果基本一致。研究报道 称，植物提取物具有较强的ABTS 自由基清除能力可能与其富含的酚类化合物有关，包括类黄酮和酚酸等[21]。这与本研究中孜然醇提物的总多酚、总黄酮含量高于水提物，故醇提物对ABTS 自由基清除效果较强的结论一致。不同提取物的ABTS 自由基清除活性的差异可能是由于不同种类提取物活性成分不同导致的。

2.4 孜然不同种类提取物清除羟自由基的能力

由图3 可以看出，在所选浓度范围内，醇提物的清除活性显著高于水提物和精油（P＜0.05），在浓度为6 mg·mL-1时，本研究的醇提物对羟自由基清除效果高于古力伯斯坦·艾达尔等[22]研究的孜然醇提液。浓度为10 mg·mL-1时，水提物、醇提物和精油的清除率对羟自由基的清除率为（82.59±1.10）%、（87.53±1.26）%和（75.27±1.26）%；孜然水提物、醇提物和孜然精油对羟自由基清除活性的IC50值分别为1.03 mg·mL-1、0.38 mg·mL-1和1.63 mg·mL-1，其中孜然精油对羟自由基的清除能力较差。THIPPESWAMY 等[23]研究发现孜然能够清除羟基自由基，是一种有效的天然抗氧化剂，并且指出其高抗氧化活性可能与其总酚含量较高有关。本实验结果与HUSAIN 等[24]的研究结果一致，他们发现C-4 位羰基官能团的存在对羟基自由基的猝灭能力起重要作用，这可能是由于孜然中具有羰基的槲皮素等化合物，对羟基的猝灭能力强，孜然醇提物中总黄酮含量高于水提物，所以孜然醇提物呈现对羟自由基较优的清除效果。

图3 孜然不同种类提取物对羟自由基的清除能力图

2.5 孜然不同种类提取物的还原力

一般认为物质的还原性与其抗氧化性之间呈正相关，还原力与抗氧化剂的能力成一定比例，吸光度值越大，说明抗氧化剂的还原力越强[25]。从图4 中可以看出，3种孜然提取物均对Fe3+有一定的还原能力，不同种类提取物的还原力有一定差异。当提取物浓度低于6 mg·mL-1时，孜然醇提物的还原力显著更高 （P＜0.05），其次为孜然水提物；而当浓度高于 6 mg·mL-1时，孜然水提物的还原力显著高于孜然醇提物和孜然精油（P＜0.05）。当浓度为10 mg·mL-1时，孜然水提物、醇提物和精油的还原力为1.32±0.02、1.08±0.01 和1.05±0.01，其中孜然精油的还原力最低。本研究中醇提物的还原力与张婷等[26]研究孜然不同部位的醇提物还原力一致。在浓度高于6 mg·mL-1时，水提物的还原力更强，这可能是水提物中的某些活性化合物（如多酚、黄酮类物质）对金属离子具有更强的螯合能力所致。另外，不同提取物的还原力的差异可能是由于提取溶剂不同，其所含抗氧化物质的数量和种类也不同，各物质的协同作用也不一致[27]。

图4 孜然不同种类提取物的还原力图

本研究结果表明不同种类的孜然提取物具有很强的抗氧化活性，这可能与其富含不同种类的活性物质密切相关[28]。有研究表明孜然中的主要活性成分是多酚类、胆碱类等化合物，这其中多酚类化合物通常具有较强的抗氧化活性[29]。ANI 等[30]研究发现孜然中的酚酸和黄酮类物质主要是没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、鞣花酸、阿魏酸和槲皮素等；吴素玲等[31]对 8 个产地的孜然活性成分及其含量进行了分析，从孜然中分离得到的芹菜素、槲皮素、木犀草素等黄酮及其苷类化合物。孜然中精油占2%～4%，但由于孜然生长环境及精油提取的差异，孜然精油的化学成分分析结果也有所不同，但主要为单萜、倍半萜、芳香族醛、酮和醚类物质，这些萜类、芳香族醛及酮醚类化合物对孜然风味的形成具有重要作用[32-33]。

本研究中孜然醇提物和孜然水提物具有良好的抗氧化活性，可能是由于这2种提取物中总多酚、总黄酮含量较高，其多酚类化合物与不同种类的自由基和氧化剂之间有较高的反应活性，能够在一定程度上清除自由基和还原金属离子[34]。二者的差异，尤其是醇提物表现出对自由基较强的清除活性，则可能是由于采用有机溶剂乙醇提取的多酚类活性成分较多所致，这与本研究中总多酚、总黄酮测定结果一致。而在孜然精油中则可能包括更多非多酚类的萜类化合物，其更容易发生自氧化反应形成不饱和脂质，表现出的抗氧化活性一般较弱，这可能是本研究中孜然精油的抗氧化活性弱于孜然醇提物和水提物的主要原因[35]。

3 结论

本研究通过对孜然不同种类提取物中的总多酚、总黄酮的定量分析，对比分析了孜然水提物、孜然醇提物和孜然精油对DPPH 自由基、ABTS 自由基和羟自由基的清除能力及还原力。结果表明，3种孜然提取物均具有一定的体外抗氧化活性，但存在不同；在较高浓度条件下（≥4 mg·mL-1），孜然醇提物表现出相对最强的DPPH 自由基清除活性；在所选浓度范围内，孜然醇提物对ABTS 自由基和羟自由基的清除活性相对最强，其次为孜然水提物，孜然精油相对最弱；在浓度高于6 mg·mL-1时，孜然水提物的还原力相对最强；醇提物中的总多酚和总黄酮含量高于水提物，所以总体而言醇提物的抗氧化活性强于水提物。综合以上结果，可以根据不同的生产需求选择不同种类的孜然提取物，在以追求较高抗氧化活性为目标时可选择孜然醇提物，在以绿色、环保为目的时可选择孜然水提物，在重视孜然风味时可选择孜然精油。