高效液相色谱法测定柠檬酸三甲酯含量及有关物质*

张 冬，王 强，毕 华，靳 玲，高燕霞

（河北省药品医疗器械检验研究院，河北 石家庄050200）

柠檬酸三甲酯又称枸橼酸三甲酯，多由柠檬酸经酸催化进行酯化反应制得［1-4］，具有生物降解性好、无毒、不易挥发、抗细菌等优点［5］，是一种环境友好型医药中间体，且性能较稳定，广泛应用于医药、食品、化工等领域。其作为样本中的微量成分之一，通常采用气相色谱（GC）法或气相色谱-质谱（GC-MS）法检测［6-10］，但对于主成分的定量分析，GC法及GC-MS法存在重复性差、仪器普及率较低等缺点。本研究中建立了测定柠檬酸三甲酯含量及有关物质的高效液相色谱法，采集并分析自制样品的表征数据，以提高其定量分析的准确性，并为其合成工艺的改进提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪、UV-2450型紫外可见分光光度仪（日本岛津公司）；Mettler XS 205型电子天平（瑞士梅特勒-托利多集团，精度为0.01 mg）。

1.2 试药

柠檬酸三甲酯对照品（上海谱振生物科技股份有限公司，克拉玛尔试剂，批号为ZY160517，含量为98%）；柠檬酸三甲酯（自制样品，批号分别为D0414，D0421，D0512）；甲醇、四氢呋喃、乙腈（色谱纯，赛默飞世尔科技＜中国＞有限公司）；磷酸二氢钠、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、磷酸二氢铵、柠檬酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：25 mmol/L磷酸二氢钠溶液（用磷酸调pH至2.5）-乙腈（90∶10，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：214 nm；柱温：35℃；进样量：20 μL。在此色谱条件下，采用强酸破坏（0.1 mol/L盐酸溶液）供试品溶液10 min，结果理论板数为9 958，拖尾因子为1.2，柠檬酸三甲酯与相邻杂质峰的分离度为12.9，符合2020年版《中国药典（四部）》［11］中方法学验证的相关规定。

2.2 含量测定

2.2.1 溶液制备

分别取柠檬酸三甲酯对照品和样品各适量，精密称定，分别加流动相溶解并稀释成质量浓度为1 mg/mL的溶液，摇匀，滤过，作为对照品溶液及供试品溶液。

取柠檬酸三甲酯对照品25 mg，精密称定，置5 mL容量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液1 mL，摇匀，放置10 min，加0.1 mol/L氢氧化钠溶液1 mL，用流动相稀释并定容，摇匀，滤过，作为系统适用性试验溶液。

2.2.2 方法学考察

线性关系考察：取柠檬酸三甲酯对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释成质量浓度分别为1.3，6.6，13.3，26.6，53.2 μg/mL的系列对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，以质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=1 061X+203.93（r=0.999 8，n=5）。结果表明，柠檬酸三甲酯质量浓度在1.3～53.2 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

定量限和检测限确定：精密量取2.2.1项下对照品溶液适量，逐级稀释，按2.1项下色谱条件进样测定，分别以信噪比（S/N）为10∶1和3∶1时的质量浓度计算柠檬酸三甲酯的定量限和检测限，结果分别为26 ng和13 ng。

精密度试验：取2.2.1项下对照品溶液20 μL，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次。结果柠檬酸三甲酯峰面积的RSD为0.04%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为D0512）适量，按2.2.1项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别于室温下放置0，1，2，3，4，5，6，8 h时进样测定。结果的RSD为0.60%（n=8），表明供试品溶液于室温下放置8 h内稳定。

加样回收试验：取样品（批号为D0512）9份，每份50 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，另分别取柠檬酸三甲酯对照品30，50，70 mg，各3份，分别置上述容量瓶中，加流动相溶解并定容，摇匀，滤过，按2.1项下色谱条件进样测定。结果柠檬酸三甲酯的平均加样回收率为99.98%，RSD为0.54%（n=9），表明方法准确度好。

耐用性试验：改变色谱柱［Thermo Hypersil GOLD C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Capcell Pak MGⅡC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、DiamonsilTMC18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）］，流速（0.9，1.0，1.1 mL/min），柱温（30，35，37℃），乙腈体积分数（9.5%，10.0%，10.5%），流动相pH（2.3，2.5，2.7），微量调整色谱条件。取样品（批号为D0512），依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。结果改变色谱条件，柠檬酸三甲酯含量的RSD不超过0.21%，表明方法耐用性好。

2.2.3 样品含量测定

取3批（批号分别为D0414，D0421，D0512）样品，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果3批自制柠檬酸三甲酯样品的含量分别为98.54%，98.89%，98.71%。

2.3 有关物质分析

2.3.1 溶液制备

取样品50 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加流动相溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL容量瓶中，加流动相稀释并定容，摇匀，滤过，作为对照溶液。

2.3.2 方法学考察

专属性试验：采用强酸（0.1 mol/L盐酸溶液10 min）、强碱（0.1 mol/L氢氧化钠溶液10 min）、高温（加热熔融）、氧化（10%过氧化氢溶液10 min）、强光照射（照度为4 500 lx，24 h）对供试品溶液进行加速破坏，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图至主成分峰保留时间的5倍。结果不同破坏途径，供试品溶液中所含杂质量均不同程度增加，酸、碱破坏供试品溶液中杂质检出量较大，提示供试品溶液在酸、碱条件下不稳定；氧化破坏对供试品溶液影响较小。色谱图见图1。杂质b及高温破坏试验中保留时间1.3倍处杂质的检出量较小，故未进行定性分析，有待进一步研究。主要产生有关物质柠檬酸、杂质a、杂质c。其中，柠檬酸杂质峰通过保留时间与柠檬酸试剂主峰保留时间的一致性进行定性；采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法初步分析杂质a与杂质c的化学结构，杂质a与柠檬酸单甲酯的化学结构一致，杂质c与柠檬酸双甲酯的化学结构一致。鉴于破坏试验中所产生的杂质峰均位于主成分峰保留时间前，仅高温破坏在主峰保留时间1.3倍处检出一杂质峰，故设定样品测定洗脱时间为主成分峰保留时间的2倍。

稳定性试验：取供试品溶液（批号为D0512）适量，分别于室温放置0，1，2，3，4，5，6，8 h时按2.1项下色谱条件进样测定。供试品溶液杂质含量随时间变化的情况见表1。可见，8 h内柠檬酸、杂质b的含量均无明显变化；3 h时杂质a含量增加较多，说明溶剂的酸性环境对样品有一定影响，可导致杂质a含量增加，这与酸破坏试验结果一致。故供试品溶液应在室温放置2 h内完成检测。

表1 稳定性试验结果（%）Tab.1 Results of the stability test（%）

2.3.3 样品有关物质测定

取3批（批号分别为D0414，D0421，D0512）样品各适量，按2.3.1项下方法制备供试品溶液；取柠檬酸三甲酯对照品（批号为ZY160517）适量，制备对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，结果3批供试品溶液中杂质总和均低于1.00%，且杂质个数及杂质含量基本一致，均优于市售克拉玛尔试剂。表明自制样品合成工艺稳定，质量满意。详见表2。

表2 有关物质测定结果（%）Tab.2 Results of determination of related substances（%）

2.3.4 质量守恒验证试验

分别用3批（批号分别为D0414，D0421，D0512）样品制备的供试品溶液的主峰峰面积与总杂质峰面积之和除以相同浓度酸破坏后的供试品溶液主峰峰面积与总杂质峰面积之和，结果分别为100.57%，99.92%，101.15%，介于98%～102%范围内，提示该方法可有效检出降解产生的杂质。

2.4 自制样品表征数据分析

红外吸收光谱：3批（批号分别为D0414，D0421，D0512）样品均在1 750～1 650 cm-1波数范围内检出三重峰，在3 500～3 250 cm-1波数范围内检出羟基峰，这符合柠檬酸三甲酯存在3个羰基、1个羟基的结构特征，与柠檬酸三甲酯对照品紫外光谱图一致。

熔点检测：自制样品的熔程为76.0～77.2℃，柠檬酸三甲酯熔程为75～78℃，可见自制样品的熔程较短，纯度较高。

表观及晶型检查：自制样品晶体洁白，透明度高，纯度较好，80倍显微镜下呈块状结晶。

3 讨论

3.1 初始流动相选择

反相键合相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入与水互溶的甲醇、乙腈、四氢呋喃等极性调整剂。研究报道，以25 mmol/L（NH4）2HPO4（用磷酸调pH至2.5）-甲醇-四氢呋喃（80∶20∶3，V/V/V）为流动相，采用2.1项下色谱条件进行重复试验，结果流动相中由于含有四氢呋喃，本底吸收较大，且四氢呋喃增加了流动相的极性，柠檬酸和柠檬酸三甲酯洗脱较快，使柠檬酸峰与溶剂峰部分叠合，无法对柠檬酸进行准确定量，另四氢呋喃对流路中peak管有一定腐蚀，故流动相中不再选择四氢呋喃。与甲醇相比，乙腈洗脱能力较强，且黏度较小，可满足在185～214 nm波长范围内检测的要求，故流动相选择乙腈。

3.2 色谱条件优化

柠檬酸是制备柠檬酸三甲酯的主要原料，柠檬酸三甲酯有关物质中是否含有柠檬酸可作为反应是否完全的依据。柠檬酸易在水中发生电离，导致出现多峰现象，影响测定。为使柠檬酸以分子形式存在，选用酸性流动相以抑制柠檬酸解离，同时加入一定比例缓冲盐保持流动相pH值稳定。

柠檬酸三甲酯和柠檬酸的分子结构中无共轭双键，其在紫外区无明显紫外吸收，但二者均在190～230 nm波长范围内有吸收带，故检测波长可选择末端吸收，为减少检测波长过低所引起的基线干扰，最终确定检测波长为214 nm。

许多缓冲液在210 nm波长附近有较强紫外吸收，使基线增高，检测灵敏度降低，对常用的4种无机盐溶液（25 mmol/L磷酸二氢钾溶液、25 mmol/L磷酸二氢铵溶液、25 mmol/L磷酸氢二铵溶液、25 mmol/L磷酸二氢钠溶液）进行紫外扫描，结果磷酸二氢钠溶液的紫外吸收光谱图较平缓，更接近基线，故缓冲液选用磷酸二氢钠溶液。

3.3 方法评价

由于无法买到正规对照品，以市售精制试剂作为柠檬酸三甲酯对照品，其含量标注不低于98%，以98%计算，3批自制样品含量实测值均大于对照品的含量，表明合成工艺良好。该方法快速、简便、精确、可靠，可为柠檬酸三甲酯的质量控制提供有效的分析方法。