有氧运动对非酒精性脂肪肝小鼠肝脏CNPY2-PERK通路的影响*

李军汉，熊 伟，王佳倩，李亚龙，蒋昌君

（1.成都体育学院运动医学与健康学院，四川 成都 610041；2.四川省人民医院肝外科，成都 610041）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）以弥漫性肝细胞脂肪性变为主要特征，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎和肝硬化等，是由酒精和其他明确的肝损伤以外因素所致的临床病理综合征［1］，其患病率在世界范围内呈上升趋势［2］，严重危害人类健康。目前，NAFLD在临床治疗上尚无特效药物［3］。研究［4］报道，生活方式改变可有效改善NAFLD。有研究表明，运动可有效抑制NAFLD的病理进展，减少肝脏脂肪沉积。近年来，运动治疗NAFLD受到国内外学者的广泛关注。然而，运动改善NAFLD的作用机制尚有待进一步研究。

冠层成纤维细胞生长因子信号调节器2（canopy fibroblast growth factor signaling regulator 2，CNPY2）在机体各组织器官广泛表达，属于Canopy家族成员（CNPY1，2，3和4）之一，由182个氨基酸组成，分子量约21 KDa，是胞浆分泌型蛋白，以心、肝、胰腺表达较高。Hong［5］报道，CNPY2是内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的重要分子组成，CNPY2正向调控PKR样内质网激酶（PKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）-C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）信号通路，是一种新的ERS起始因子。CNPY2的研究仍处于起步阶段，有关CNPY2-PERK通路的文献见于人脐静脉内皮细胞缺血/再灌注［6］的研究报道。最新研究［7］发现，有氧运动可有效改善NAFLD，其机制与有氧运动调控肝脏PERK-CHOP信号通路有关。然而，CNPY2-PERK信号通路在有氧运动改善NAFLD中是否发挥作用，尚未见文献报道。本研究通过高脂膳食喂养诱导NAFLD小鼠模型，采用有氧运动干预，探讨有氧运动对NAFLD小鼠肝脏CNPY2-PERK通路的影响，以期为运动防治NAFLD的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与模型制备

8周龄雄性C57/BL6J小鼠，SPF/VAF级，体重为（20.1±1.2）g，许可证编号：JSNJ（苏）2020-0003，由江苏集萃药康生物科技有限公司提供。所有小鼠在成都体育学院实验中心小动物房内分笼饲养，相对湿度45%～55%，室温18～22℃，自由饮食饮水，12 h阴暗交替。所有小鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法分为对照组（C）、对照+运动组（CE），NAFLD模型组（M）和NAFLD模型+运动组（ME），每组10只。C组和CE组给予普通饲料喂养18周，M组和ME组给予高脂饲料喂养18周，高脂饲料配方如下：猪油28%、全脂奶粉10.8%、蔗糖5.6%、微晶纤维素1.6%、酪蛋白11.5%、磷酸氢钙1.8%、实验动物预混料2%、石粉0.4%、基础饲料38%，此配方中能量占比约60%来源于脂肪，21%来源于糖，19%来源于蛋白质［8］。普通饲料和高脂饲料均由江苏协同医药生物工程有限责任公司提供［编号：苏饲证（2020）01008］。在实验第9周，从各组中分别随机抽取2只小鼠，禁食12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉取肝脏左叶做油红O病理形态检测，结合血脂变化，以确认模型制备成功［9］。第10周开始，CE组和ME组进行有氧跑台训练。

1.2 跑台训练方案

跑台训练方案参考现有文献［10］。运动组小鼠先进行1周适应性跑台训练，初始速度为8 m/min×10 min，20 min/d，每天以0.5 m/min的速度 和10 min/d的时间递增，直至运动时间达到60 min/d，运动速度达到12 m/min，正式运动持续8周，每周运动5 d，直至实验结束。

1.3 样本采集与处理

为避免运动应激反应，实验结束后48 h取材。以4 ml/kg腹腔内注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉，摘取小鼠眼球取血。以腹部正中切口打开腹腔，迅速取出肝脏，称肝湿重。肝脏一部分用4%多聚甲醛固定，用于HE染色和免疫组化检测；一部分固定包埋，用于冰冻切片和油红O染色；另一部分放置于液氮中速冻，转入-80℃冰箱储存，用于Western blot和qRT-PCR检测。

1.4 肝脏病理形态

用4%多聚甲醛将肝组织固定，常规石蜡包埋，切片后苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察肝组织病理学改变。采用NAS评分［11］标准对肝组织脂肪性变进行病理学评分。肝组织常规油红O染色，脂滴为红色，脂滴光密度采用IPP 6.0图像分析系统进行分析。

1.5 血液生化指标

全自动生化仪检测小鼠血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、总甘油三酯（total triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-c）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-c）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平，检测方法严格按照试剂盒说明书进行。

1.6 Western blot

取肝组织加入RIPA裂解液裂解后提取肝组织中总蛋白。50μg蛋白样品经12.5%SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳分离后，电转移至硝酸纤维素膜上，经5%脱脂奶粉室温下封闭1 h。5%BSA-TBST稀释一抗CNPY2（1：400），PERK（1∶500），p-eIF2a（1∶1 000）、CHOP（1∶1 000），β-actin（1∶10 0000），5%BSA-TBST稀释HRP结合的羊抗兔IgG（1∶5 000），ECL发光法曝光，显影，定影。β-actin作为内参，用Gel-pro32图像分析软件进行分析，蛋白表达量用“目的蛋白/β-actin”计算。

1.7 qRT-PCR

按照Trizol试剂盒说明书提取肝组织总RNA，逆转录获得eDNA，采用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测各组肝组织CNPY2，PERK基因的表达水平。反应条件：95℃×30 s，95℃×3 s，55℃×30 s，72℃×30 s，45个循环。每个样本重复检测3次，以β-actin作为内参，计算相对量，采用2-ΔΔCT法分析。引物设计见表1，由上海生工公司设计合成。

Tab.1 Oligonucleotide primers used for qRT-PCR

1.8 免疫组化

免疫组化严格按照SABC免疫组化染色试剂盒说明书操作步骤进行。DAB显色，常规脱水、透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察，棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，用IPP 6.0免疫组化分析软件进行定量分析。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 各组肝脏病理形态变化

肝脏病理结果显示：C组和CE组肝细胞内可见少量脂肪性变和脂滴，肝小叶结构清晰；M组肝细胞内充满大量脂肪空泡，肝细胞脂肪性变显著，肝细胞内可见大量脂滴；ME组肝细胞脂肪性变程度和脂滴数量位于C组和M组之间（图1）。肝细胞脂肪性变积分结果显示：M组肝细胞脂肪性变积分和脂滴密度较C组显著升高（P＜0.05），ME组肝细胞脂肪性变积分和脂滴密度较M组显著降低（P＜0.05），CE组肝细胞脂性变积分和脂滴密度与C组比较，没有显著性差异（P＞0.05，表2）

Fig.1 The hepatic pathological changes in mice of each group（Bar=10μm，×400）

Tab.2 Comparisons of the quantification of histological pathology in mice of each group（±s，n=8）

Tab.2 Comparisons of the quantification of histological pathology in mice of each group（±s，n=8）

C：Control；CE：Control+Exercise；M：Model；ME：Model+Exercise；AIOD：Average integrated optical density area*P＜0.05 vs C group；#P＜0.05 vs M group

Group Histology ratings（Points）Density of lipid drops（AIOD，μm2）C 0.857±0.143 0.06±0.001 CE 0.574±0.202 0.04±0.001 M 3.857±0.143* 0.29±0.004*ME 1.714±0.286# 0.17±0.002#

2.2 各组体重和肝指数变化

各组小鼠体重结果显示（表3），实验开始时，各组小鼠体重无显著性差异（P＞0.05）；数周后，M组和ME组小鼠体重增长快速，至第9周末，M组小鼠体重显著高于C组（P＜0.05），ME组体重较M组没有显著性差异（P＞0.05）；实验结束时，M组体重较C组显著升高（P＜0.05）；ME组体重较M组显著降低（P＜0.05），CE组体重较C组没有显著性差异（P＞0.05）。肝湿重和肝指数（肝指数=肝湿重/体重）结果显示，M组肝湿重和肝指数较C组显著升高（P＜0.05），ME组肝湿重和肝指数较M组显著降低（P＜0.05），CE组肝湿重和肝指数与C组比较，没有显著性差异（P＞0.05）

Tab.3 Comparisons of the body weight and liver index in mice of each group（±s，n=8）

Tab.3 Comparisons of the body weight and liver index in mice of each group（±s，n=8）

C：Control；CE：Control+Exercise；M：Model；ME：Model+Exercise*P＜0.05 vs C group；#P＜0.05 vs M group

Group Original body weight（g）The ninth body weight（g）Final body weight（g）Liver weight（g） Liver index（%）C 20.020±0.198 26.920±0.361 29.130±0.501 0.812±0.023 2.729±0.071 CE 19.650±0.150 25.760±0.585 26.680±0.369 0.759±0.022 2.678±0.115 M 20.420±0.324 38.000±1.077* 50.450±1.092* 1.884±0.161*3.664±0.221*ME 19.700±0.283 35.300±0.887 41.010±1.199# 1.041±0.058#2.581±0.087#

2.3 各组血液生化指标变化

小鼠血液生化指标结果显示（表4）：M组血清ALT、AST、TC、TG和LDL-c含量较C组显著升高（P＜0.05），ME组以上指标较M组显著降低（P＜0.05）；M组血清HDL-c含量较C组显著降低（P＜0.05），ME组血清HDL-c含量较M组没有显著性差异（P＞0.05）；CE组以上血液生化指标与C组比较，没有显著性差异（P＞0.05）。

Tab.4 Comparisons of the serum lipid and liver function enzymes in mice of each group（±s，n=8）

Tab.4 Comparisons of the serum lipid and liver function enzymes in mice of each group（±s，n=8）

C：Control；CE：Control+Exercise；M：Model；ME：Model+Exercise*P＜0.05 vs C group；#P＜0.05 vs M group

Group TG（g/L） TC（g/L） HDL-c（g/L） LDL-c（g/L） ALT（U/L） AST（U/L）C 0.817±0.063 2.820±0.152 3.932±0.211 0.240±0.007 40.530±4.784 140.600±13.150 CE 0.667±0.018 2.662±0.064 3.813±0.080 0.202±0.012 39.620±3.831 130.000±13.920 M 1.422±0.142* 5.760±0.304* 2.102±0.066* 1.175±0.088* 167.800±25.410*203.500±8.664*ME 0.865±0.065# 4.893±0.229# 2.477±0.068 0.618±0.050# 58.080±4.870#154.800±9.034#

2.4 各组肝组织CNPY2-PERK通路蛋白表达变化

Western blot结果显示（表5，图2）：M组CNPY2、PERK、p-eIF2a、CHOP蛋白表达较C组显著升高（P＜0.05）；ME组以上指标较M组显著降低（P＜0.05）；CE组以上指标与C组比较，没有显著性差异（P＜0.05）。

Tab.5 The relative expressions of CNPY2-PERK pathway in mice of each group（±s，n=6）

Tab.5 The relative expressions of CNPY2-PERK pathway in mice of each group（±s，n=6）

C：Control；CE：Control+Exercise；M：Model；ME：Model+Exercise*P＜0.05 vs C group；#P＜0.05 vs M group

Group CNPY2 PERK p-eIF2a CHOP CNPY2 mRNA PERK mRNA C 0.369±0.039 0.654±0.131 0.709±0.033 0.692±0.050 0.713±0.095 0.910±0.166 CE 0.255±0.024 0.589±0.125 0.712±0.055 0.625±0.062 0.697±0.052 0.810±0.049 M 0.655±0.035* 1.469±0.143* 1.099±0.044* 0.954±0.024* 1.227±0.027* 1.843±0.203*ME 0.459±0.019# 0.695±0.131# 0.767±0.043# 0.704±0.091# 0.890±0.026# 1.220±0.109#

Fig.2 The relative expressions of proteins in CNPY2-PERK pathway

2.5 各组肝组织CNPY2/PERK通路mRNA表达变化

qRT-PCR结果显示（表5）：M组CNPY2 mRNA和PERK mRNA表达较C组显著升高（P＜0.05）；ME组以上指标较M组显著降低（P＜0.05）；CE组以上指标与C组比较，没有显著性差异（P＞0.05）。

2.6 各组肝组织CNPY2、PERK阳性表达变化

免疫组化结果显示：CNPY2和PERK阳性产物主要分布在细胞质及细胞间质，M组各蛋白表达较C组范围广，着色深；ME组各蛋白表达较M组范围少，着色浅；C组和CE组各蛋白表达最少，着色最浅（图3）；CNPY2、PERK蛋白阳性表达结果显示，M组CNPY2、PERK蛋白阳性表达较C组显著升高（P＜0.05），ME组上述指标较M组显著降低（P＜0.05），CE组上述指标与C组比较，没有显著性差异（P＞0.05，表6）。

Fig.3 The positive staining of CNPY2 and PERK in mice of each group（Immunohistochemistry，Bar=40μm，×400）

Tab.6 Comparisons of the percentage of positive staining of CNPY2 and PERK in mice of each group（%，±s，n=6）

Tab.6 Comparisons of the percentage of positive staining of CNPY2 and PERK in mice of each group（%，±s，n=6）

C：Control；CE：Control+Exercise；M：Model；ME：Model+Exercise*P＜0.05 vs C group；#P＜0.05 vs M group

Group The positive staining of CNPY2 The positive staining of PERK C 0.180±0.001 0.240±0.003 CE 0.110±0.001 0.110±0.001 M 0.590±0.005* 2.530±0.007*ME 0.250±0.003# 0.380±0.003*#

3 讨论

NAFLD多发生于40～60岁人群，其主要病理学特征为肝细胞内脂质沉积，早期病理仅为单纯性肝细胞脂肪样变，而中晚期会继发炎性细胞浸润、肝细胞凋亡和坏死。NAFLD最初被认为是一种良性肝病，但现在被认为是代谢综合征在肝脏的表现［12］。临床上NAFLD除了依靠病史、症状、体症进行诊断外，其主要的实验室手段包括血脂和肝功能酶水平检测、肝脏B超、CT、MRI和活检，其中，病理组织学是诊断NAFLD的金标准［13］。本研究采用高脂饮食诱导NAFLD小鼠模型，肝脏病理形态结果显示M组肝细胞脂肪性变和脂滴数量较C组显著增加，提示本研究NAFLD动物模型复制成功。

减少体重被广泛认为是治疗NAFLD最有效的手段之一，而运动常常作为重要的减体重手段［14］。本研究结果显示，有氧运动可有效减缓高脂膳食诱导的体重增加。脂质代谢紊乱是诱发NAFLD的主要因素之一，TC、TG、LDL-c、HDL-c为反映肝脏脂代谢的重要指标［15］。本研究结果显示，高脂膳食诱导血清TC、TG、LDL-c显著升高，HDL-c显著降低，而有氧运动显著降低血清TC、TG、LDL-c水平。研究［7］报道，中低强度有氧运动和递增强度有氧运动均可有效降低血清TC、TG、LDL-c水平，提示运动改善NAFLD脂代谢，不受运动强度或训练方案的影响。研究发现，运动改善脂代谢是影响肝脏脂质沉积的独立因素，与体重变化无关［16］。ALT、AST作为肝损伤的标志性转氨酶，常被作为评价肝损伤的指标。在生理状态下，ALT、AST主要存在于肝细胞胞浆内，当NAFLD产生时，肝细胞膜的结构与功能严重受损，细胞膜通透性增加，ALT、AST进入血液，导致血清ALT、AST水平升高。研究［7］报道，中高强度体育活动和中低强度体育活动可显著降低NAFLD患者血清ALT、AST水平，提示不同强度的运动锻炼均可有效缓解NAFLD肝损伤。

PERK/eIF2a/CHOP信号通路是ERS介导细胞凋亡的主要途径之一，研究［17］发现，PERK/eIF2α通路具有调节脂肪生成和脂肪变性的功能。研究［5］报道，CNPY2敲除可以阻断PERK/eIF2a/CHOP通路，对衣霉素诱导的急性NAFLD和高脂诱导的NAFLD均有较强的保护作用。本研究结果显示，高脂膳食诱导小鼠肝脏CNPY2-PERK信号通路相关分子表达升高，有氧运动显著降低CNPY2-PERK信号通路相关分子表达，提示CNPY2-PERK信号通路参与NAFLD形成，有氧运动有效改善NAFLD，其机制可能与其显著降低CNPY2-PERK信号通路相关分子表达有关。

运动对NAFLD的影响，与运动方式、运动强度和运动量有关。研究［7］报道，有氧运动与抗阻运动改善NAFLD的效果相似，中等强度有氧运动或高强度间歇训练均有效减少肝脏TG，而80%最大摄氧量的大强度运动反而加重NAFLD。本研究结果显示，较长时间的中等强度有氧运动可有效抑制高脂膳食诱导的NAFLD。有趣的是，与C组比较，CE组小鼠肝组织结构、体重、肝指数、血脂和肝功能酶水平、以及肝脏CNPY2-PERK信号通路相关分子表达均未见显著性差异，提示有氧运动可有效减轻NAFLD小鼠病理结构变化，改善NAFLD小鼠血脂紊乱和肝功能酶水平，下调NAFLD小鼠肝脏CNPY2-PERK信号通路相关分子表达，但对于健康小鼠，有氧运动不具上述特点和作用。研究［18］报道，持续6周的跑台训练，无论是低强度，中等强度，递增强度还是大强度，正常大鼠肝脏中PERK的表达均未见显著变化，而长期训练后肝脏中的PERK有明显下降［19］。我们推测，本研究中有氧运动对正常肝脏未有显著性影响，可能与运动时间较短有关。

综上所述，CNPY2-PERK信号通路参与高脂膳食诱导NAFLD的形成。有氧运动可有效改善NAFLD，其机制可能与有氧运动降低CNPY2-PERK通路相关分子表达有关