血型正反定型不符和凝集减弱的原因分析及处理

刘玉敏 张 韦 邵晓琳

滨州市中心血站 山东 滨州 256602

ABO血型的表型是由正反定型两者决定的，正定型检测红细胞抗原，反定型检测血清或血浆中抗体。正反方向ABO血型抗原和抗体的同时检测才能完成ABO血型的定型[1]。对于正反定型不一致的标本应当查找分析原因，加以解决。导致正反定型不一致的原因有技术问题和献血者红细胞或血浆本身问题。虽然献血者均是健康个体，但部分献血者因输血史、妊娠史及其他原因导致血浆中产生不规则抗体，自身红细胞抗原或血浆抗体减弱，天然抗体的存在以及冷凝集等而致血型定型困难。对于正反定型不符的血液标本必须进一步鉴定，确定血型，分析其能否用于临床或留做其它用途。本研究对144例ABO正反定型不符和/或凝集减弱血液标本原因及相关血液的处理进行回顾性分析，报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2016年1月至2020年9月在212 261名无偿献血者中共检出正反定型检测结果不一致和/或凝集程度减弱者144例。

1.2 仪器与试剂 抗-A、抗-B、抗-AB、抗-H、抗-M、抗-N、抗-S、抗-P1、A2细胞、人ABO 反定型用红细胞(A1、B、O)和抗体筛查红细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及谱细胞等(试剂均由上海血液生物医药有限公司提供)。 离心机(KA-2200 日本久保田)、离心机(LDZ4-0.8 北京医用离心机)、电热恒温水箱(37℃ 金坛瑞华)、电热恒温水箱 (56℃ 天津泰斯特)、试剂专用冰箱(2～8℃ 日本三洋)。

1.3 检测方法

1.3.1 盐水试管法ABO正反定型检测 首先用生理盐水对待检测标本红细胞进行3次洗涤，然后用盐水介质试管法作进一步确认，并做O细胞及自身细胞。正定型血型检测根据实际情况加做抗AB和抗H。正常情况下正定型血型检测标本其红细胞与抗-A或抗-B凝集强度均不小于4+，反定型血浆与A型细胞或B型细胞凝集不小于2+，与O细胞及自身细胞均为不凝集。盐水试管法ABO正反定型检测方法见文献[2]。若检测结果无法对应时，将其放入4℃冰箱30 min后离心观察结果，放置至室温再次离心观察结果。

1.3.2 吸收放散试验、冷凝集素试验、抗体筛查或抗体鉴定试验(盐水介质抗体鉴定方法) 通过对照抗体鉴定谱细胞格局表对可疑抗体再用相应检测试剂检测该标本红细胞上是否有相应抗原。具体检测方法见文献[2]。

1.3.2.1 吸收放散试验 对于正定型单克隆抗A、抗B直接凝集试验检测不到抗原，甚至通过降低反应温度或增加抗体强度仍检测不到的弱抗原，而反定型检出相应抗体的标本需做吸收放散试验。检测方法：取1 mL压积红细胞用生理盐水洗涤至少3遍，最后1遍吸弃所有上清；加入1 mL抗血清(怀疑A亚型者加抗A试剂，怀疑B亚型者加抗B试剂)；混匀红细胞和抗体试剂放入4℃冰箱1 h，期间每隔10 min混匀一次，同时将备用生理盐水放入4℃冰箱；1 h后离心混合物，彻底移除上清试剂后将红细胞转移至10 mL干净试管，用4℃盐水洗涤8遍，将末次洗涤液分装到新试管中(与放散液做平行试验用)；红细胞中加入等容积生理盐水，置56℃水浴箱中10 min，孵育期间定时轻轻振摇试管，以便使吸附在红细胞上的抗体充分放散；立刻用(900～1 000)×g离心2 min，立即分离上清放散液于一干净试管；和末次洗涤液做平行试验。分别与3个O细胞和3个A1细胞或B细胞反应(根据吸收试验所加抗体试剂选择合适的A1细胞或B细胞)。试管上均用记号笔做好标记，两组试管中分别加入放散液和末次洗涤液2滴，相应红细胞试剂1滴，立即离心观察结果；若没观察到凝集，放4℃冰箱30 min后取出立即离心观察凝集。结果有效性判定：末次洗涤液与所有6个细胞均不发生反应；放散液与所有3个O细胞不发生反应；放散液与相应抗原红细胞发生反应。在试验有效的前提下，放散液与相应红细胞试剂有反应则证明放散液中有抗A或抗B,说明待检测标本红细胞上有A或B抗原表达。用A1、B或O平行进行吸收放散试验，作为该试验的阳性或阴性对照。

1.3.2.2 冷凝集素试验 当正定血型为A型、B型或AB型而反定血型与同型红细胞试剂有凝集或弱凝集时均做冷凝集素试验，同时检测冷凝集素滴度。取4支试管，用记号笔做好标记(滴加A试剂红细胞的标为Ac；滴加B试剂细胞的标为Bc；滴加O试剂红细胞的标为Oc；滴加经过生理盐水三洗后的自身细胞标为自c)。每管中加待检测血浆2滴，再在做好标记的试管中加入相应红细胞1滴,第一步立即离心观察凝集情况；第二步放入4℃冰箱30 min,取出立即离心观察结果；第三步室温放置约30 min,观察凝集现象是否消失；第四步室温下凝集未消失的再放入37℃水浴箱观察凝集现象。对于冷凝集强度较高的标本进行倍比稀释，操作如下：取10支试管，分别标记为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，于每管中加入100 μL生理盐水；于第1管中加入100 μL待检测标本血浆,彻底混匀；然后从第1管中取100 μL混匀样本加入第2管，再彻底混匀；依次操作至第10管，第10管彻底混匀后弃去100 μL,每管中加入相应的红细胞置4℃冰箱30 min后立即离心观察凝集现象.以肉眼可见的有明显凝集的最后一管的滴度定为该标本的冷凝集滴度。

2 结果

144例送检标本中，ABO正反定型不符者112例，占比为77.78 %。正反定型相符但凝集程度减弱者32例，占比为 22.22%(表1、2)。

表1 112例正反定型不符原因

表2 32例正反定型相符凝集程度减弱原因

为保证输血安全有效，检出不规则抗体的血液其红细胞制备成洗涤红细胞(效期同去白悬浮红细胞)发往临床共计133.5单位(200 mL全血制备的洗涤红细胞为1单位；300 mL全血制备的洗涤红细胞为1.5单位；400 mL全血制备的洗涤红细胞为2单位)。正常发往临床：去白悬浮红细胞为107.5单位；新鲜冰冻血浆为4 400 mL；病毒灭活血浆为6 050 mL；冰冻血浆为200 mL。质量控制检测用：去白悬浮红细胞为10.5单位；新鲜冰冻血浆为5 600 mL；病毒灭活血浆为7 600 mL；冰冻血浆为800 mL；冷沉淀为3单位。报废处理：去白悬浮红细胞为5.5单位；新鲜冰冻血浆为400 mL；病毒灭活血浆为160 mL。

3 讨论

212 261例无偿献血检测标本中,检验科不能正确定型者144例，但血型室通过鉴定共有112例ABO正反定型不符，约占0.05%，明显高于李革飞[3]报道的0.02%，低于刘二雄[4]报道的献血者ABO正反不符阳性率0.131%；其余32例可能因实验室条件差异，不足以判定为正反定型不符。

112例ABO正反定型不符标本中用盐水介质抗体鉴定法共有101例检出不规则抗体，占无偿献血检测标本的0.048%，略高于蔡茵报道的无偿献血者中不规则抗体盐水介质反应性确证阳性数0.031%[5]，明显低于相关报道在正常人体内不规则抗体检出率0.2%～2.5%[6]，这与本次研究只采用盐水介质中凝集红细胞，以 IgM 类抗体居多，而大多数IgG类抗体不能检出有关。不规则抗体是导致正反定型不符的主要原因(101/112，占比90.18%)。其中抗-M41例(36.61%)，明显高于刘二雄[4]报道的26.1%，这可能与研究区域有关。人血清抗-M抗体相对来说是比较常见的自然发生的抗体。4例自身冷抗体，室温有活性，37℃无活性，效价小于16；22例室温无活性未确定特异性冷凝集素抗体，其原因分析为检测方法及不同实验室温度条件有关。8例抗A或抗B抗体减弱标本中以抗-B减弱居多占75%，抗A减弱占25%。

ABO亚型也是导致正反定型不符的其一原因。ABO亚型虽然少见，但它会严重影响输血的安全性和有效性[7]。ABO亚型主要是经血型血清学试验以抗原性弱为主要特征的多种表型[1]，其共同特点是红细胞上A或B抗原数量减少,正定型中红细胞与抗A,抗B试剂的反应与正常A或B型红细胞相比显著减弱,有些甚至不凝集。某些ABO亚型血清中除了ABO天然抗体之外,还会产生抗A1(或抗B)[2]。对可疑标本进行盐水试管法ABO正反定型检测，依次在室温、4℃ 30 min、恢复室温后三种条件离心观察判读结果，同时加做抗A,B、抗H、O细胞及自身对照，根据需要做吸收放散试验。根据ABO血型血清学试验特点，按文献[8]判定为亚型标准：共检出26例ABO亚型：3例通过吸收放散试验检出相应抗原，但不伴有不规则抗A、B；23例为凝集减弱或混合视野:6例检出不规则抗A、抗B,其中5例为抗-A1抗体5/6(83.33%)，实验现象为室温凝集较弱或不凝集，4℃加强，为冷反应抗体，1例抗-B抗体1/6(16.67%)，实验现象为室温凝集较弱。与许志远等[7]报道的ABO亚型中分别检出不规则抗-A占84.9%，抗-B占15.1%基本相符。据研究分析发现对于造成正反不符的亚型一般不会漏检，但表现为正反定型相符，正定血型凝集程度减弱的容易造成亚型漏检，这就对检验科血型检测提出更高的要求。

不规则抗体阳性不仅导致血型鉴定困难，还会在交叉配血时致使次侧配血不合。临床在输注非红细胞制品如新鲜冰冻血浆、病毒灭活血浆、冷沉淀及冰冻血浆时均为同型输注而不交叉配血。如将含有不规则抗体的血液输注给患者时就有可能产生输血反应。对这一类血液制品做如下处理：根据《血站技术操作规程》质量控制部分规定全血及成分血抽样量为每月制备量的1%或至少4袋。为节约血液，ABO正反定型不符，血浆中检出不规则抗体的非红细胞制品用于质量控制检测血液质量的其他指标，这与刘二雄报道的非红细胞制品应废弃[4]不同；红细胞制品制备成洗涤红细胞(效期同去白悬浮红细胞)发往临床，这一做法与刘二雄[4]报道的红细胞三洗后可用于临床相同。既避免了血液的浪费，又保证了血液的安全。ABO亚型血液通过吸收放散试验检出相应抗原的，对该血液进行报废处理，并进行系统屏蔽停止献血，有专门人员告知献血者；对于仅表现为正定型凝集减弱或混合视野，血浆中未检出不规则抗体的，该血液正常发往临床；血浆中检出不规则抗体的，该血液所有产品均做质量控制检测使用。室温无活性的冷凝集素抗体血液正常发往临床。为避免误发往临床，对以上所有不能直接发往临床或用于质量控制检测用的血液产品均由专门人员将其详细信息填写《内外沟通记录》一式两份交于下游科室。专门人员在记录上签字留档，按要求将相关产品予以特殊标识进行洗涤或留做质量控制检测用，并进行物理性隔离。对于发往临床的该类洗涤红细胞，通过临床跟踪无一例发生输血不良反应，临床治疗效果良好。

综上所述，造成ABO正反定型不符的原因颇多，工作人员在实际操作中应该细心审慎，综合分析研判，根据实际情况对相应血液做最佳处理，既确保临床用血安全有效，又最大程度避免血液浪费。