蒙药蓝刺头对去卵巢大鼠骨密度、M-CSF、股骨头形态的影响*

赵 军 刘 岩 李 昕 董重阳 田广芳 王雄耀 师建平 常 虹 高小明 莫日根 王振华

(1.内蒙古自治区中医医院中医内科中医科, 内蒙古 呼和浩特 010020; 2.内蒙古医科大学附属医院, 内蒙古 呼和浩特 010050; 3.内蒙古医科大学中医学院, 内蒙古 呼和浩特 010110; 4.甘肃省中医院痹症科, 甘肃 兰州 735000)

骨质疏松(Osteoporosis,OP)属蒙医经典文献“骨枯症”范畴。由“肾主骨生髓，髓养骨”“肾虚骨枯髓减”等古医籍阐发，蒙医认为OP根本病因为肾虚。绝经后骨质疏松(Postmenopausal osteoporosis, PMOP)因女性绝经后卵巢功能衰退致，属高转换型OP。19世纪蒙医著作经典《通瓦嘎吉德》记载：“老年人赫依偏盛，易骨枯，治以补为主，补暖补精，而抑赫依过剩”[1，2]。蒙药蓝刺头性凉，味苦，效轻、稀、柔、钝，可接骨愈伤、固骨质[3]。本实验通过观察蒙药蓝刺头对去卵巢OP模鼠血清M-CSF、左侧股骨头破骨细胞(OC)骨吸收陷窝数量调节，观察变化。

1 材料与方法

1.1 实验药品、试剂 蒙药蓝刺头制剂：广州中医药大学科技产业园提供。强骨胶囊：北京岐黄制药有限公司，规格：0.25 g/粒，30粒/瓶，产品批号：188103，国药准字Z20030007。己烯雌酚片：合肥久联制药有限公司，规格：0.5 mg/片，产品批号：20180925，国药准字H34021250。巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)ELISA试剂盒：北京博奥森生物技术有限公司提供；甲苯胺蓝染液；5%碱性美蓝溶液；PBS缓冲液。

1.2 实验动物 4月龄Wistar大鼠雌性84只，购于内蒙古大学实验动物中心，合格证号：SCXK(蒙)2002—0001。内蒙古医科大学基础实验楼病理实验室饲养，每笼12只，购回适应环境7 d左右。

1.3 实验

1.3.1 分组、模型制备 对84只大鼠随机平均分7组[蓝刺头高、中、低剂量组及强骨胶囊组、己烯雌酚组、模型组、假手术组(以下分别简称高组、中组、低组、强组、已组、模组假组)]。参考高小明等[4]的研究行PMOP模型复制，假手术组不切卵巢只切卵巢周围少量脂肪，缝合创口后5 d，将大鼠阴道脱落细胞涂片确定造模成功(见图1、图2)。

图1 雌鼠光镜下动情期阴道涂片(400×)

图2 雌鼠光镜下动情间期阴道涂片(400×)

1.3.2 药物干预、标本采集 90 d后行药物干预灌胃给药。蒙药蓝刺头低、中、高剂量组据人鼠体质量比、人鼠代谢速率比折算以6.875 0 mg/mL、13.750 0 mg/mL、27.500 0 mg/mL给药，临床等效剂量低剂量组为准，剂量比例高、中、低为4∶2∶1。己烯雌酚0.031 3 mg/mL、强骨胶囊23.437 5 mg/mL，均按有效成人量给药；生理盐水体积相应对假手术组、模型组灌胃。终每组按9只计。采血离心；剖取双侧股骨4%甲醛液固定。

1.4 检测指标

1.4.1 骨密度仪右侧股骨BMD计量学指标分析 骨密度仪离体骨BMD测定见表1。

1.4.2M-CSF变化 M-CSF试剂盒说明书步骤行，用酶联仪测各孔吸光度(OD)值(见表2)。

1.4.3 甲苯胺蓝染色方法检测股骨头破骨细胞骨吸收陷窝计数 (1)大鼠股骨脱钙、蜡块制备[5]；(2)甲苯胺蓝染色，梯度酒精脱水甲苯胺蓝固体(Toluidine blue O)1.0 g+70%酒精(Alcohol)100.0 mL+1%氯化钠(Sodium chloride)900 mL染色观察。每组大鼠取5张切片(n0)，每张切片随机选5个视野(n1)，光学显微镜观察各组染色情况，采用医学图像分析系统，光镜下骨OC骨吸收陷窝计数(n2)(见表3、图3)。

2 结果

2.1 右侧股骨BMD计量学指标变化 显微CT扫描大鼠右侧股骨近心端，测BMD示：模组与假组相比差异有显著统计学意义(P<0.01)；中、低/组，假组、强组、己组与模组比差异有显著统计学意义(P<0.01)；高组与模组相比差异无统计学意义(P>0.05)；低组、中组、己组、强组、假组与高组比差异有统计学意义(P<0.05)；中组、低组、强组、己组、假组之间比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠右侧股骨BMD计量学指标变化比较

2.2 大鼠血清M-CSF变化 大鼠血清M-CSF表达模组较假组、中剂组、己组、强组明显降低(P<0.01)；高、低组与模组比差异无统计学意义(P>0.05)；高、低组与强组、己组、中组、假组比差异有统计学意义(P<0.05)；强组、己组、中组、假组比差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清M-CSF比较

2.3 各组大鼠左侧离体股骨头破骨细胞骨吸收陷窝计数 左侧股骨头甲苯胺蓝染色观察OC骨吸收陷窝数，模组与假组比差异有统计学意义(P<0.05)；中、低组、强组、己组与模组比差异有统计学意义(P<0.05)；高组与模组相比差异无统计学意义(P>0.05)；中、低组、己组、强组、假组与高组比差异有统计学意义(P<0.05)；中、低组、强组、己组、假组之间比差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图3。

表3 各组大鼠左侧离体股骨头OC骨吸收陷窝数比较

注：a：高剂量组；b：中剂量组；c：低剂量组；d：强骨胶囊组；e：己烯雌酚组；f：模型组；g：假手术组。

3 讨论

OP骨微结构改变，全身骨量减少，骨脆性增加，骨折易发。OP包括原发、继发，原发最常见，多发绝经后中老年妇女，全身老年性改变在骨骼系统反映。在骨骼细胞形成分化的过程中，有炎症因子的参与。破骨细胞的成熟与分化信号之一是通过成骨细胞提供的巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)与表达于破骨细胞前体细胞表面的同源受体 c-fms 进行传递。M-CSF 主要存在于骨髓腔中，它与 RANKL 同时作用于骨髓中破骨前体细胞的表达。实验表明，绝经后可以导致M-CSF 水平的升高[6]。OC发育、功能是影响骨吸收重要环节。能否在骨形成骨吸收陷窝评价OC是否真正功能“金标准”[7]。实验表明蒙药蓝刺头在适当剂量可抑制去卵巢大鼠血清M-CSF表达、OC骨吸收陷窝形成，提高BMD，起一定抗骨破坏、保护骨作用。还需行大量实验研究验证。

综上，大鼠在去卵巢以后血清M-CSF表达、OC骨吸收陷窝数均明显增高，BMD明显降低；蒙药蓝刺头能使血清M-CSF表达、OC骨吸收陷窝数目明显降低，效果同己烯雌酚、强骨胶囊相似，能有效抗骨破坏、保护骨，为蒙医“补暖补精-清镇赫依-固骨质壮骨”理论防治PMOP提供实验依据，其详细机制还需进一步研究。