不同浓度海藻糖对西门塔尔公牛精子活力的影响

高汉婷，衡军材，汪聪勇，栗敏杰，李若玺，高留涛

（河南省鼎元种牛育种有限公司，河南 郑州 450000）

20世纪70年代我国就已经开始牛精液冷冻保存的研究，但是解冻后的精子活力特别是解冻后存活时间的长短已经跟不上目前技术发展水平的要求，人工授精后返情率和空怀率偏高。大型牛场同期处理后，每一位输精员要负责上千头母牛输精，都会选择将冻精一次性解冻，从第一头输精开始到最后一头输精结束要经过好几个小时，这样精子存活时间就显得尤为重要。笔者探讨在稀释液中加入一些特殊的成分，能够延长精子的存活时间，节省精子能量，提高精子活力。

海藻糖是一种非还原性糖，它由两个葡萄糖分子通过糖苷键链接而成，这种稳定性的结构决定了海藻糖稳定的自身性质。海藻糖对生物有抗脱水、抗冷冻和抗高渗保护作用，是因为其在恶劣环境条件下，在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征［1］。海藻糖己普遍应用到大分子生物和细胞的低温和冷冻保存中，尤其是作为一种非渗透性冷冻保护剂在胚胎、精子和各类体细胞的冷冻保存等方面应用广泛。

该试验以新鲜牛精液为试验材料，添加不同浓度的海藻糖，观察低温保存条件下不同存活时间的精子活力的变化，为生产高质量的精子提供理论指导。

1 材料和方法

1.1 试验材料

所有样本均采自河南省鼎元种牛育种有限公司种公牛站的健康公牛精液。

“法官，按我的理解，你的意思是，当着我和我那几个小孩子的面，无缘无故地杀害我丈夫的这个人是无罪的？法律对他只能这样了？”“没错，两种说法都一样。”我回答。

课堂上，由教师主体变成学生主体是“放”。只有放，才能避免教师唱独角戏，让学生进入课堂，使课堂变为“教师、教材和学生”构成的“三元课堂体系”。道家说：“一生二，二生三，三生万物。”有了“三元课堂体系”，课堂上才有可能生出充满活力的万物，课堂才能出现“涨潮”和“落潮”的起伏，才能散发出真正的生命活力。

当代青年的文明素养和思想道德建设离不开传统文化。文化的传递性使中国传统文化得以延续，任何一个国家的建设都无法脱离本民族的优秀传统文化。我们对于当代青少年的培养也离不开中国传统文化的引导与熏陶，传统文化的传承与创新也有赖于青少年的继承与发扬光大。中华传统文化有利于青少年建立正确的人生观、价值观、世界观。有利于培养青少年以爱国主义为核心的民族精神。传统文化对于青少年的思想熏陶和人格塑造都有着不可否认的积极作用，能够帮助青少年丰富文化知识、提升思想境界，学会如何处理好人际关系，对于树立青少年正确的价值取向有着积极作用。

BIM技术发以来，参数化、模型化、可视化和协同工作是其实际应用的基本特征[1]。将其纳入建筑工程项目信息管理实践，建筑工程项目信息管理的效率和质量得以有效提升，并且，在信息重复、信息误差等内容的控制方面具有重大影响。当前环境下，BIM技术已深刻的贯穿于生命周期的各个环节，其对于工程质量提升，工程效益获得具有较为深刻的影响作用。因此在现代工程建设中，在建筑工程项目信息管理中进行深层次的BIM技术应用势在必行。

主要耗材：新鲜鸡蛋、相差显微镜、电子天平、恒温水浴箱、5.0 ml 试管、试管架、载玻片、盖玻片、血细胞计数器、移液枪、250 ml烧杯、100 ml量筒。

主要试剂：葡萄糖、Tris、柠檬酸、海藻糖、甘油。

1.2.3 精子活力检测

1.2 试验方法

1.2.1 精液稀释液的配制

1.2.2 精液稀释和样品的采集

采用假阴道采精法采集牛精液，并对精液品质进行检测。用于冷冻保存的新鲜精液指标必须满足：活力大于65%，精子密度高于6×109/ml，畸形率小于15%。将符合标准的牛新鲜精液用等温稀释液进行稀释，而后分装于0.25 ml 细管内，平衡2～4 h 后用冷冻仪进行冷冻，最后将细管投入液氮罐中冷冻保存。

A组即基础液：称取Tris 2.424 g、柠檬酸1.344 g、葡萄糖1.0 g、卵黄15 ml溶于超纯水中，搅拌均匀，再加入甘油5 ml，继续搅拌均匀，然后放入58℃水中巴氏消毒30 min，等消毒完毕后放入凉水中冷却，冷却后加入青霉素10万国际单位，链霉素10万国际单位在磁力搅拌器上搅拌均匀放入4℃冰箱备用。

配制不同浓度的海藻糖组：在上述配制好的A 组液（基础液）中加入海藻糖，A 组0 mol/L为对照组，B 组0.1 mol/L、C组0.2 mol/L、D组0.3 mol/L、E组0.4 mol/L 5个浓度梯度。

试验分组：根据海藻糖浓度的不同分别设置了A、B、C、D和E5个浓度梯度。

现代农业是把农业建立在现代科学的基础上，利用现代化科学技术、现代工业来装备农业，用智能化来管理农业，创造一个高产、优质、低耗的农业生产体系。其最终目标是建立发达、富庶的农业和创造良好的环境。其特征包括机械化、科学化、产业化、信息化和提高劳动者的素质。

24 h以后置于37℃水浴解冻，然后分成3组，第1组立即在显微镜下检测活力，取3支解冻好的细管冻精剪去封口端推入小玻璃管中混匀，取10 μl在37℃恒温板上等温预热的载玻片上滴片，盖上盖玻片后置于配有37℃恒温台的显微镜下放大400倍观测活力。3 h以后用同样的方法检测第2组的活力即3 h活力，再过3 h即检测解冻后6 h活力。

1.3 数据统计分析

用SAS8.0 软件进行方差分析，试验结果以平均值表示。

2 结果

添加不同浓度海藻糖后不同存活时间活力（见下表）。

表 添加不同浓度海藻糖后不同存活时间活力

试验结果表明B组在各阶段活力均优于其他组，尤其是各组精液在解冻后3 h、6 h 活力呈现先增后降，在B 组处呈现最佳，活力都显著高于其他组，且差异显著（P＜0.05）；E组精子能量损失最少，表明膜保护力最好，但是解冻0 h活力不达标。

3 讨论

精液稀释液的目的是增加精液的含量，通过降低精子能量消耗，补充适量营养和保护物质，抑制精液中有害微生物的活力，以延长精子的寿命，便于保存和运输。在该试验中，基础液中添加不同剂量的海藻糖，虽然都具有相同的成分，但浓度不同，稀释时对精子的作用也不同，最终导致了不同的冷冻效果。海藻糖的自身性质很稳定，在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等较差环境条件下可在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征［1-3］。杨文瑾［4］试验报道在低温保存液里分别添加0.028 mol/L、0.014 mol/L、0.046 mol/L 的海藻糖，对牛精液进行低温保存，结果发现，海藻糖的剂量越高，精子活力越强。南向斌［5］研究发现在稀释液中添加2%、4%、6%、8%、10%的海藻糖，观察牛精液的冷冻保存效果，结果发现4%的海藻糖能显著提高精子的活力与活率。胡建宏等［6］通过添加比例为25%、50%、75%、100%的海藻糖到稀释液中对猪精子进行冷冻保存，结果发现，比例为25%的海藻糖稀释液精子的活率最大。张树山等［2］对猪精子进行冷冻保存时发现，稀释液中添加不同浓度海藻糖，可提高精子的顶体完整率，且精子顶体完整率会随浓度的升高而增大，但没有显著性差异（P＞0.05）。张勇［7］试验报道稀释液中分别添加40 mg/100 ml、60 mg/100 ml、80 mg/100 ml与100 mg/100 ml的4组不同浓度的海藻糖，4℃条件下保存鸡精液，顶体完整率和畸形率差异均不显著（P＞0.05）；但是100 mg/100 ml组中精子顶体完整率最高为（88.90±2.84）%，且顶体完整率会随浓度的增大而增大。该试验中添加海藻糖后B 组在各阶段活力均优于其他组，尤其是解冻后3 h、6 h活力随着海藻糖浓度的增高呈现先升高后下降的趋势，在B组处呈现最佳状态，其活力显著高于其他组，说明海藻糖浓度为0.1 mol/L 时精子活力好；而E组3 h精子活力变化不大，说明精子能量损失最少，表明膜保护力最好，进一步表明随着保存时间的延长，海藻糖的性质越来越好。该试验结果表明，海藻糖浓度越高，0 h的精子的活率越低，而不含海藻糖的0 h的精子存活时间越短。这可能与海藻糖在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，同时保护质膜的完整性有关，具体机理还需进一步验证。