水族抗痹症方抗痛风性关节炎的实验研究

2022-09-07 13:05王海萍周美春陈慧敏周春翠吉杨丹臧贵勇
黔南民族医专学报 2022年2期
关键词:痛风性白介素造模

王 恒,王海萍,周美春,陈慧敏,周春翠,吉杨丹,刘 曦,臧贵勇

(1.黔南民族医学高等专科学校,贵州 都匀 558013;2.黔南州妇幼保健院,贵州 都匀 558000;3.黔南民族医学高等专科学校附属医院,贵州 都匀 558000)

痛风是一种严重危害人类健康的代谢性疾病。其主要病因是由于长期嘌呤代谢障碍,血尿酸增高,尿酸沉积在关节囊、滑膜等关节组织导致的急性炎症反应,引起组织损伤的临床综合征[1]。在痛风发病过程中,白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α作为主要的炎症因子能激活下游的很多信号通路,在痛风性关节炎炎症反应中起重要作用[2]。目前用于治疗痛风性关节炎的药物主要为秋水仙碱、苯溴马隆、别嘌醇、糖皮质激素等,但不良反应很多[3]。民族民间中有许多治疗痛风临床效果良好的药方,但作用机制及安全性没得到实证[4]。本课题拟以挖掘民族良方为目的,建立大鼠痛风关节炎模型,以不同浓度水族抗痹症方灌胃干预,观察其是否具有治疗痛风性关节炎的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 尿酸钠购自于Sigma公司,批号:BCCF5862;白介素1-β,批号:20201228、白介素6,批号:20201227、肿瘤坏死因子-α ELISA,批号:20201229试剂盒均购自于北京诚林生物公司;尿酸测定试剂盒,批号:202001025购自于南京建成生物工程研究所有限公司。秋水仙碱片(规格:0.5 mg)购于云南植物药业有限公司。显微镜E200型(日本尼康),酶标仪MR-96A型(深圳迈瑞)等。

1.2 抗痹症方的制备 由于该配方为保密方,故只列举其中两种药材刺五加、雷公藤。按照其配方组成用53度白酒浸泡3个月以上所制成的酒剂。

1.3 实验动物与分组 清洁级SD雌性大白鼠60只,体质重(200±20)g,分笼饲养。随机分为6组,即空白对照组,模型对照组,阳性对照组(秋水仙碱,9 mg/kg),抗痹症方(5 ml/kg)、中(2.5 ml/kg)、低(1.25 ml/kg)剂量治疗组,每组10只。

1.4 建模及灌胃 痛风性关节炎建模:除空白对照组外,其他各组均用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉,仰卧固定,用6号注射针右侧踝关节后侧从30~40°方向插入至跟腱内侧,将0.2 ml尿酸钠溶液(50 mg/ml)注入关节腔内。空白对照组同样采用6号注射针右侧踝关节后侧从30~40°方向插入至跟腱内侧,将0.2 ml生理盐水注入关节腔内。秋水仙碱治疗组给予9 mg/kg秋水仙碱灌胃,水族抗痹症方高、中、低剂量组分别给5、2.5、1.25 ml/kg剂量灌胃,空白对照组和模型给予蒸馏水20 ml/kg灌胃,1次/d,连续7 d。

1.5 指标检测

1.5.1 大鼠足踝关节肿胀率的测算 造模前1 h及造模后24 h、7 d后测量关节周径,并计算肿胀率。肿胀率(%)=(造模后关节周径-造模前关节周径)/造模前关节周径×100%。

1.5.2 大鼠血清中尿酸、白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α的含量测定 末次给药1 h后,股动脉取血,静置,离心,取上清液,在-20℃下保存待测。血清尿酸采用比色法,白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α的含量采用ELISA法测定,按照试剂盒说明书操作。

1.6 统计学方法 数据分析采用SPSS21.0统计软件进行,计量资料以均数±标准差表示,采用单因素方差分析,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠足踝关节肿胀率及血清尿酸的结果 造模24 h,各组大鼠肿胀率未见明显差异。与模型组比较,造模后7 d阳性组、水族抗痹症方中、高剂量组大鼠肿胀率明显减轻(P<0.05)。与空白组比较,模型组大鼠血清尿酸含量明显上升(P<0.05);与模型组比较,阳性组、水族抗痹症方低、中、高剂量组大鼠血清尿酸含量明显下降(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠足踝关节肿胀率及血清尿酸的比较

2.2 各组大鼠血清中白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α含量测定的结果 与空白组比较,模型组大鼠血清中白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α含量均明显升高(P<0.05);与模型组比较,阳性组、抗痹症方高剂量组大鼠血清白介素1-β含量明显下降(P<0.05);阳性组、抗痹症方中、高剂量组大鼠血清白介素6含量明显下降(P<0.05);阳性组、抗痹症方低、中、高剂量组大鼠血清肿瘤坏死因子-α含量明显下降(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠血清白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α的比较

2.3 各组大鼠踝关节滑膜病理切片观察的结果 见图1,正常组(图1A)关节滑膜结构层次分明,细胞排列整齐,未见炎细胞浸润;模型组(图1B)踝关节滑膜见明显充血、水肿,滑膜可见大量淋巴细胞等炎细胞浸润,可见少许纤维细胞增生;与模型组相比,阳性组、水药抗痹症方不同剂量组(图1C、图1D、图1E、图1F)大鼠关节滑膜充血、水肿情况有不同程度减轻,淋巴细胞浸润情况相对减轻,未见纤维细胞增生;其中,阳性组与高剂量组滑膜充血、水肿情况以及炎细胞浸润最轻。

图1A正常组 图1B模型组 图1C阳性组

图1D低剂量组 图1E中剂量组 图1F高剂量组

3 讨论

近年来,由于中国经济水平快速提升,群众生活及饮食习惯发生了极大的改变,痛风发病率亦相应地上升[5]。患者体内尿酸升高,并且达到过饱和状态时,会以结晶形式析出并沉积在关节腔内,导致痛风性关节炎的发作。炎症因子在痛风性关节炎的发病、发展过程中起到重要作用[6]。痛风性关节炎患者关节液中存在大量的单核细胞-巨噬细胞,吞噬尿酸结晶时会释放大量白介素1-β与肿瘤坏死因子-α等细胞因子,可增加前列腺素类物质的合成而产生疼痛性感觉,并进一步激活环氧化酶使炎症扩大[7-8]。其中,IL-1β可以与受体结合,使滑膜细胞、内皮细胞产生大量的细胞因子如IL-6等,加速了炎细胞在尿酸盐沉积关节周围浸润[9]。IL-6是具有多种功能的炎性细胞因子,在痛风性关节炎炎症反应中关键成分。在痛风性关节炎急性期IL-6呈明显高表达,并且与病情活动性呈正相关,它不仅能增加滑膜炎性细胞浸润,还在反复发病中起到促进软骨细胞凋亡的作用[10]。

通过大鼠踝关节局部注射尿酸盐晶体混悬液复制急性痛风性关节炎模型,已经被证实具有操作简便,可控性高,重复性好的优势,目前应用最多[11]。梁莎等[12]报道该方法造模后大鼠病理切片显示关节腔内大量炎症细胞浸润,以及出现关节滑膜水肿等变化,与本实验造模后模型组大鼠病理表现一致。而且本实验模型组大鼠血清中白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α含量均不同程度升高,造模后24 h内大鼠踝关节出现明显肿胀、皮肤发红,功能障碍等急性炎症表现,表明大鼠痛风性关节炎模型复制成功。本实验造模24 h,各注射组大鼠肿胀度未见明显差异。造模后7 d后,阳性组、水族抗痹症方中、高剂量组大鼠与模型组比较肿胀度明显减轻(P<0.05)。与空白组比较,模型组大鼠血清中尿酸、白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α含量均明显升高(P<0.05)。与模型组比较,阳性组、抗痹症方高剂量组大鼠血清白介素1-β含量明显下降(P<0.05);阳性组、抗痹症方中、高剂量组大鼠血清白介素6含量明显下降(P<0.05);阳性组、水族抗痹症方低、中、高剂量组大鼠血清尿酸、肿瘤坏死因子-α含量明显下降(P<0.05)。踝关节镜下病理观察可见,与模型组相比,阳性组、水药抗痹症方不同剂量组(图1C、图1D、图1E、图1F)大鼠关节滑膜充血、水肿情况有不同程度减轻,淋巴细胞浸润情况相对减轻,未见纤维细胞增生;其中,阳性组与高剂量组滑膜充血、水肿情况以及炎细胞浸润最轻。本实验证实抗痹症方不同剂量组均可降低痛风性关节炎大鼠关节肿胀情况,还可通过降低血清中尿酸、白介素1-β、白介素6、肿瘤坏死因子-α含量的作用,减轻关节滑膜炎症反应。水药抗痹症方在大鼠痛风性关节炎症状和炎症因子方面效果显著,值得继续深入研究。

由于本方提供者不愿意公开药方组成,因此没有对组方特点进行分析,本组方中的中药材需要制成酒剂或者酊剂才能发挥疗效,本实验所用剂量换算成人用量每天40、20、10 ml,课题组前期已做了其急性毒性实验[13],此剂量在安全范围内。本实验亦证实该方具有降低血清尿酸的效果,为今后民族方药开发与利用奠定了理论基础。

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