髓外病变和调节T细胞对多发性骨髓瘤嵌合抗原受体T细胞治疗疗效的影响

王佳 翟志敏 葛健 王兴兵 董毅

作者单位：230601 合肥 1安徽医科大学第二附属医院血液科；230032 合肥 2安徽医科大学第一附属医院血液科；230001 合肥 3中国科学技术大学附属第一医院血液科

靶向B细胞成熟抗原（B cell mature antigens，BCMA）的嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cells，CAR-T）疗法在复发难治性多发性骨髓瘤（relapsed/refractory multiple myeloma，RRMM）治疗中取得了较好的应答率，总体缓解率（overall remission rate，ORR）为73%～98%，完全缓解（complete remission，CR）率为31%～69%［1-3］。但是也有研究发现，部分多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者尽管体内的CAR-T细胞持续存在，但最终依然会复发［4］。目前，影响这部分患者缓解持久性的因素尚未明确。既往研究显示，多种因素均可影响CAR-T的治疗反应及其耐药，包括细胞制备前T细胞的特征、CAR-T细胞相关特征、CAR-T细胞的丢失、肿瘤细胞表面抗原表达的丢失导致获得性抵抗治疗以及削弱T细胞活性的免疫抑制微环境有关克隆的出现等［4-5］。本课题组前期研究发现髓外病变（extramedullary diseases，EMD）和调节T细胞（regulatory T cells，Tregs）是复发难治急性淋巴细胞白血病患者CAR-T治疗的预后不良因素［6］。基于此，本研究进一步探索EMD及Tregs对BCMACAR-T细胞治疗RRMM疗效及预后的影响，以期为BCMA-CAR-T疗法的优化提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2019年6月至2021年9月在安徽医科大学第二附属医院血液科、安徽医科大学第一附属医院血液科、中国科学技术大学附属第一医院血液科收治的RRMM患者的临床资料。纳入标准：⑴至少接受3线治疗或对免疫调节剂和蛋白酶体抑制剂耐药；⑵年龄≥18岁；⑶符合国际骨髓瘤工作组（international myeloma working group，IMWG）2016诊断标准。排除标准：⑴肝肾功能异常，伴心脏疾病（包括超声心动图EF＜50%），心功能不全（心功能分级NYHA：Ⅲ/Ⅳ）者；⑵患有其他脏器恶性肿瘤者；⑶乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）及结核病患者活动期，人类免疫缺陷病毒（HIV）阳性患者；⑷合并未控制的严重感染或代谢性疾病者；⑸不能理解或不遵从研究方案者。本研究通过伦理委员会批准（伦理号：PJ-YX2019-015）并在中国临床试验注册中心注册（注册号：ChiCTR2000040368），患者均签署知情同意书。

1.2 治疗方案

所有患者经预处理化疗后均采用BCMA-CAR-T细胞制剂治疗。预处理化疗方案：氟达拉滨（30 mg/m2，静脉注射，每天1次，连续3 d）联合环磷酰胺（300 mg/m2，静脉注射，每天1次，连续3 d）；预处理化疗结束后的第2天静脉输注BCMA-CAR-T细胞制剂，输注平均剂量为3.5×106个CAR阳性T细胞/kg。输注28 d后进行骨髓形态学、免疫固定电泳等检查，评估缓解状态；第30～180天，每月监测血常规、肝肾功能、电解质、乳酸脱氢酶、β2-微球蛋白、免疫球蛋白定量、血清免疫固定电泳、尿免疫固定电泳、血清游离轻链、骨髓形态学及骨髓病理，之后每3个月检测1次。随访期间，若发现可疑的复发症状，立即检查并给予相应挽救治疗。

1.3 信息收集及定义

通过住院及门诊病历收集患者的临床和实验室相关资料，包括年龄、性别、化疗线数、复发次数、预后危险分层、ECOG评分、骨髓原幼浆细胞比例、Tregs、EMD等基线特征。EMD定义为骨髓外异常浆细胞浸润，通过磁共振成像或正电子发射计算机断层扫描确定病变部位，并通过细胞学或病理活检检测肿块中的浆细胞。Tregs检测方法：所有患者进行CAR-T细胞治疗前均抽取2～5 mL外周血，肝素化管抗凝，4 h内检查；取100 μL外周血，与特异性单抗（FITC-CD25-单抗、PE-CD127-单抗、PC5.5-CD4单抗）于25℃下孵育15 min，红细胞被裂解后，用流式细胞仪FC-500快速评估，并使用CXP 2.0软件分析。同期收集10名健康人的Tregs，其正常值范围为4.29%～6.17%。当Tregs水平大于正常值上限时定义为Tregs水平异常增高组，否则定义为Tregs水平正常或较低组。

1.4 疗效和安全性评价

MM的疗效评估参考2016年IMWG疗效标准［7］，分为CR、非常好的部分缓解（very good partial remission，VGPR）、部分缓解（partial remission，PR）、疾病稳定（steady disease，SD）、疾病进展（progression disease，PD）、复发；ORR为CR、VGPR及PR的率的总和。根据2014年IMWG的预后评估体系进行危险分层［8］，其中低危指国际分期系统（international staging system，ISS）Ⅰ或Ⅱ期且没有t（4；14）或17p13-和1q21+，中危指不符合低危及高危标准，高危指ISS分期Ⅱ/Ⅲ期且t（4；14）或17p13-。采用美国国立癌症研究院通用毒性标准（CTCAE 3.0）评估不良事件，分为1～5级；根据美国血液与骨髓移植学会2018年发布的共识分级系统［9］对细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）和免疫效应细胞相关的神经毒性综合征（immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS）进行诊断和分级（1～4级）。

1.5 随访

通过电话、门诊复查进行随访，随访截至2021年12月。主要观察指标为患者持续缓解时间（duration of response，DOR）、无复发生存期（relapse-free survival，RFS）和总生存期（overall survival，OS）。DOR定义为自评估为CR、VGPR或PR至第一次评估为PD或因任何原因死亡的时间，RFS定义为从接受BCMA-CAR-T细胞开始至疾病复发或因疾病进展死亡的时间，OS定义为从接受BCMA-CAR-T细胞开始到末次随访或因任何原因死亡的时间。

1.6 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。患者特征采用描述性统计，分类变量组间比较采用Fisher精确概率法，DOR、RFS及OS采用Kaplan-Meier方法进行评估，采用Cox回归模型对临床及实验参数进行单因素分析，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基本特征

共33例RRMM患者符合标准纳入研究，其中6例患者因培养失败未进行细胞输注，3例患者放弃治疗，最终纳入24例。24例RRMM患者中位年龄为62岁（范围：35～70岁），其中男性14例，女性10例；原发难治性3例、曾接受自体造血干细胞移植2例、曾使用CD38单抗1例；高危15例；治疗线数大于3次11例；有EMD 5例，其中浆细胞白血病2例，侵犯中枢神经系统1例，同时累及多部位浸润2例；外周血Tregs水平高于正常值上限15例，其余9例Tregs水平正常或较低。24例RRMM患者的基线资料详见表1。

表1 24例RRMM患者的基线特征［n（%）］Tab.1 Baseline characteristics of the 24 RRMM patients［n(%)］

2.2 EMD和Tregs对缓解率的影响

输注BCMA-CAR-T细胞2个月内，所有患者的ORR为87.5%，CR为50.0%，VGPR为29.2%，PR为8.3%。有EMD患者的ORR及CR明显低于无EMD患者，差异有统计学意义（χ2=4.318，P=0.038；χ2=2.460，P=0.014）；Tregs水平异常增高患者的ORR及CR与Tregs水平正常或较低患者比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表2。

2.3 EMD和Tregs对患者DOR的影响

BCMA-CAR-T细胞治疗后RRMM患者的缓解程度与DOR存在相关性，其中达到CR、VGPR及PR患者的中位DOR分别为16.6个月、7.8个月及3.5个月，不同缓解程度患者的DOR比较差异有统计学意义（χ2=25.323，P=0.001），见图1。有无EMD患者的中位DOR分别为5.333（95%CI：1.359～9.307）个月和13.611（95%CI：10.600～16.622）个月，差异有统计学意义（χ2=8.318，P=0.004）；Tregs水平异常增高患者与Tregs水平正常或较低患者的中位DOR分别为8.917（95%CI：6.849～10.984）个月和18.250（95%CI：13.438～23.062）个月，差异有统计学意义（χ2=11.479，P=0.001），见图2。

图1 患者缓解深度对持续缓解时间的影响Fig.1 Effects of depth of remission on duration of response

图2 EMD和Tregs对患者持续缓解时间的影响Fig.2 Effects of EMD and Tregs on duration of response

2.4 EMD和Tregs对患者OS及RFS的影响

随访截至2021年12月，中位随访15.2个月（范围：2.1～29.0个月），总体OS率为79.2%，RFS率为54.2%。有无EMD患者的OS率分别为60.0%、84.2%，差异有统计学意义（χ2=6.187，P=0.013），见图3A；Tregs水平异常增高患者与Tregs水平正常或较低患者的OS率分别为73.3%、88.9%，差异无统计学意义（χ2=3.128，P=0.077），见图3B。有无EMD患者的RFS率分别为40.0%、57.9%，差异有统计学意义（χ2=7.397，P=0.007），见图4A；Tregs水平异常增高患者与Tregs水平正常或较低患者的RFS率分别为40.0%、77.8%，差异有统计学意义（χ2=6.478，P=0.011），见图4B。

图3 EMD和Tregs对患者总生存的影响Fig.3 Effects of EMD and Tregs on overall survival

图4 EMD和Tregs对患者无复发生存的影响Fig.4 Effects of EMD and Tregs on relapse-free survival

进一步采用单因素Cox回归分析接受BCMACAR-T细胞治疗患者的基线特征与OS、RFS的关系，结果显示，有无EMD患者的OS和RFS差异均有统计学意义（HR=8.465，95%CI：1.150～62.315，P=0.036；HR=5.569，95%CI：1.332～23.285，P=0.019），Tregs水平异常增高患者与Tregs水平正常或较低患者的RFS差异亦有统计学意义（HR=8.806，95%CI：1.088～71.282，P=0.017）。

2.5 安全性评价

所有患者总体耐受性良好，不良反应以血液学毒性反应为主，包括中性粒细胞减少症（83.3%）、贫血（41.7%）和血小板减少症（45.8%）。发生CRS 19例（79.2%），神经系统毒性反应2例（8.3%），未见因不良反应死亡病例。有无EMD组及Tregs水平高低组患者在BCMA-CAR-T细胞治疗中总体不良事件的发生率差异无统计学意义（均P＞0.05），见表3。

表3 有无EMD及Tregs水平高低患者的不良反应发生情况［n（%）］Tab.3 The adverse reactions of patients with or without EMD and Tregs level［n(%)］

3 讨论

BCMA-CAR-T疗法在RRMM患者中显示出良好的疗效，但也有部分患者无效或持久性较差，而患者特殊的临床特征如EMD、Tregs、基线肿瘤负荷、ISS分层高危等可能是其中原因之一［1，10］。当克隆浆细胞生长在远离骨髓的解剖部位，或生长在突破皮质骨的骨病变附近时，称为EMD。EMD是MM的一种罕见表现，其特征是累及单个或多个器官，包括皮肤、肝脏、淋巴系统、胸膜和中枢神经系统等。在新诊断的MM患者中，EMD发病率为3%～5%，而在复发MM患者中EMD发病率高达20%［11］。既往研究显示，EMD的存在与MM更具侵袭性的表型、血清乳酸脱氢酶升高和高危细胞遗传学如17p缺失、t（4；14）、t（14；16）有关［12］。EMD治疗方案通常遵循高危MM的治疗方案，但预后很差，仅接受化疗患者4年OS率和无进展生存（progression-free survival，PFS）率分别为54%和29%；单次自体移植作为巩固治疗并没有明显改善患者生存，但接受双次自体移植后OS率和PFS率分别为83%和52%，该策略可能会克服不良预后［13］。关于BCMA-CAR-T细胞疗法，有研究报道部分合并EMD的RRMM患者可在短期内受益于BCMA-CAR-T细胞疗法，为桥接造血干细胞移植、放疗和其他治疗提供了时间［14］。也有研究显示，有无EMD的RRMM患者接受人源化抗BCMA-CAR-T细胞治疗后ORR和短期内的PFS及OS无明显获益，但是随着时间延长伴EMD患者的PFS和OS率低于无EMD患者［15］。本研究也发现，有EMD的RRMM患者ORR、DOR以及RFS率和OS率均较无EMD患者明显降低，与上述文献［15］报道相似，提示EMD可能是RRMM患者BCMA-CAR-T细胞治疗预后不良的指标。BCMA-CAR-T细胞治疗不能改善EMD患者的结局，提示BCMA-CAR-T细胞治疗可能不能改善这部分患者的复发问题。因此，对于高Tregs水平患者如何改善其免疫重建，优化CAR-T设计，是需要考虑的问题［16-17］。目前，对于伴EMD的患者，建议通过优化CAR设计、增强持久性和活性的组合方法、优化预处理方案、采用双抗原靶向以防止抗原逃逸、减少化疗线数、早期应用CAR-T细胞治疗等途径提高CAR-T细胞治疗效力［18-19］。

免疫损伤是MM的一个重要特征，骨髓微环境高度免疫抑制涉及体液和细胞免疫系统，包括未受影响的免疫球蛋白水平降低和功能失调的T细胞反应，同时也与MM患者发病、复发甚至死亡相关。肿瘤微环境中的Tregs在抑制肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用，高Tregs水平能促进免疫逃逸和肿瘤生长，致使预后不良［20］，同时Tregs细胞亚群对CAR-T细胞治疗恶性肿瘤疗效的影响及可能机制也已有初步探讨［6，10，21］。但目前 Tregs与BCMA-CAR-T细胞治疗疗效的关系鲜见报道。为了明确Tregs对BCMACAR-T细胞疗效的影响，本研究进一步分析Tregs水平异常增高以及Tregs水平正常或较低患者的近期疗效，结果发现Tregs水平高低并不影响患者的总体缓解率，但Tregs水平异常增高患者的DOR明显缩短，总体RFS率也明显降低，表明高水平Tregs患者接受BCMA-CAR-T细胞治疗后，Tregs可能影响CAR-T细胞在体内进一步扩增及作用的持久性，提示高水平Tregs患者的复发风险较高。

血液学毒性是BCMA-CAR-T细胞治疗最常见的不良反应，本研究中CRS发生率为79.2%，ICANS为8.3%，与文献［22］报道结果（CRS为 80.3%，ICANS为10.5%）相似。进一步分析有无EMD以及高低Tregs水平患者的不良反应发生率情况，也未发现其差异性，同时均未见治疗相关死亡事件，说明BCMA-CAR-T疗法在RRMM患者治疗中具有良好安全性，EMD及高Tregs水平并未增加CAR-T细胞治疗的不良反应风险。

综上所述，本研究发现EMD及Tregs水平可影响RRMM患者的BCMA-CAR-T细胞治疗疗效，合并EMD患者近期疗效及生存较差，Tregs水平异常增高可能是其复发的危险因素，但两者并不影响BCMA-CAR-T疗法的不良反应。但本研究纳入的病例数以及随访时间有限，且为回顾性研究，因此有关结论仍需进一步验证。