糖尿病介导的周细胞损伤对脊髓损伤后血脊屏障破坏的作用

蔡淑芳， 徐婧语， 吴艳青

(温州大学 生命与环境科学学院-生命科学研究院, 浙江温州 325035)

脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是各种外伤导致的中枢神经系统严重创伤，常使患者的运动、感觉功能以及自主支配能力丧失。脊髓损伤包含2个阶段，即外界因素对脊柱直接机械性损伤以及机械损伤后的血脊屏障(blood-spinal cord barrier, BSCB)被破坏，组织水肿、电解质紊乱、缺血以及炎症发生造成的继发性损伤。继发性损伤是脊髓在损伤修复过程中所面临的主要障碍。目前，脊髓损伤主要的治疗手段是手术减压、损伤稳定、二次并发症的预防与管理以及病人的再适应。糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种代谢异常性疾病，可引发中枢神经病变和周围神经病变等一系列并发症。糖尿病与脊髓损伤密切相关。相比正常人，糖尿病患者更容易诱发脊髓损伤；而脊髓损伤患者由于运动能力下降，能量消耗减少，也更易发展为肥胖、高血糖、高血脂和胰岛素抵抗等糖尿病症状。随着糖尿病患者逐渐增多，糖尿病合并脊髓损伤患者和脊髓损伤诱发急性高血糖的患者也在日益增加。因此，深入探究糖尿病对脊髓损伤修复的影响及相关调控机制，并采取一定治疗策略缓解糖尿病对脊髓损伤修复的影响，是临床上治疗糖尿病合并脊髓损伤重点解决的问题。本文将综述糖尿病介导的周细胞损伤对脊髓损伤后血脊屏障破坏的作用，为临床上治疗糖尿病合并脊髓损伤提供新的理论依据。

1 周细胞在脊髓损伤血脊屏障修复中的作用

1.1 周细胞在血管系统中的作用

周细胞(又称Rouget细胞或壁细胞)最早由Rouget于1873年发现，1923年Zimmermann将其命名为周细胞[1]。周细胞的细胞质常形成小行星状突起。周细胞主要分布在血管基底膜外，在基底膜上与内皮细胞紧密相连。周细胞通过缝隙连接、紧密连接、局部粘连和可溶性因子与内皮细胞进行信息传递沟通[2]。周细胞与微血管内皮细胞之间的连接在维持血脊屏障和血脑屏障(blood brain barrier, BBB)正常功能中至关重要。在不同的组织中，根据时间和空间分布，周细胞具有特定功能的亚群。目前认为，周细胞分型包括2类，一类是周细胞1型和2型，以神经/胶质细胞2型硫酸软骨素糖蛋白(neuron-glial antigen 2，NG-2)[3]和黑色素瘤细胞粘附分子(CD146)[4]为特异性标记物；另一类是周细胞A型和B型，特异性标记物分别是血小板衍生生长因子受体-β(platelet-derived growth factor receptor-β, PDGFR-β)[4]和结蛋白[5]。以上4种不同特异性标记物是周细胞研究中最常见也是最重要的亚型，在不同的病理条件有不同的影响。

周细胞参与血管生成，包括器官发育过程中成血管细胞形成新血管，成年人现有血管形成新血管，以及病理性血管生成过程(例如损伤后的血管重塑/形成)[6, 7]。血管生成过程分为3个主要步骤：(1)引发；(2)血管发芽和迁移；(3)成熟/终止。当内皮细胞和周细胞暴露于促血管生成素环境时，就会启动血管生成反应，从而导致周细胞与毛细血管基底膜的接触减少[8]。大多数成熟的周细胞放射状突起减少，分支点减少；相反，未成熟状态的周细胞分支点增加，可以促进血管增生，促进内皮细胞增殖[9]。有研究表明，周细胞的丢失可导致败血症微血管功能障碍[10]。在血管生成过程中，周细胞成熟也是血管重塑所必需的。

在调控血管生成过程中，周细胞受到一系列信号通路共同调控。研究证实，脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/AKT)是血管形成过程中调节周细胞增殖和成熟的重要机制。在血管生成启动时，机体激活PI3K信号通路，促进周细胞进行大量增殖；在血管重塑过程，机体将抑制周细胞中的PI3K信号通路，上调周细胞成熟相关基因[9]。周细胞分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)从而介导内皮细胞增殖与血管生成的过程也是由PI3K/AKT调控[11]。反之，内皮细胞也会分泌PDGFR-β，作用于下游效应分子磷脂酶Erk1/2，促进周细胞增殖[12]。Notch通路也是调控血管新生和微血管重构的重要通路[13]。周细胞上表达Notch3受体，Notch配体结合周细胞上的Notch3受体，切割Notch的细胞内结构域(notch intracellular domain, NICD)，NICD被激活后可促进下游靶基因转录表达，参与调控血管系统的完整性(Fig. 1)。此外，转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)信号通路也是调控血管稳定的重要通路之一。TGF-β在周细胞、内皮细胞、神经元和胶质细胞上均有表达[14]。TGF-β与周细胞和内皮细胞上的TGF-β受体2(TGF-β receptor 2, TGFβR2)结合，并可激活素受体样激酶5(activin receptor like kinase 5, ALK5)，从而激活下游Smad信号级联反应[15-17]。激活的Smad2/3抑制周细胞增殖和迁移，而将Smad4募集到Smad2/3转录复合物可促进周细胞分化，促进收缩/细胞外基质(extracellular matrix, ECM)蛋白表达。在调控血管过程中，TGF-β/TGFβR2-Smad4信号通路与Notch-NICD途径可协同刺激J区重组信号结合蛋白(recombination signal binding protein for Ig Kappa J region, RBPJ)，介导N-钙黏着蛋白表达，从而增加BBB稳定性(Fig. 1)。

Fig.1 The regulatory signaling pathway of pericytes on angiogenesis After binding with the receptor, PDGFR-β activates ERK1/2 and promotes the proliferation of pericytes. The pericytes can secrete VEGF, and then participate in the PI3K/AKT pathway regulating angiogenesis. The TGF-β that secreted by pericytes binds to TGFβR2 and induces phosphorylation of activin receptor-like kinase 5(ALK5) (which is inhibited by Smad7), thereby activating downstream of Smad signaling cascades. Activated Smad2/3 inhibits proliferation and migration of pericytes. The recruitment of Smad4 into the Smad2/3 transcription complex promotes pericyte differentiation, and induces the expression of extracellular matrix (ECM) proteins and the attachment of pericytes. In addition, TGF-β inhibits nitric oxide (NO) production and promotes pericyte survival. Moreover, the activation of Notch3 receptor cleaves the intracellular domain (NICD) of Notch and transplants it into the nucleus to promote the expression of nuclear protein, thereby promoting pericyte survival. The Notch-NICD signaling pathway and TGF-β/TGFβR2-Smad4 signaling pathway can co-regulate the RBPJ-mediated N-cadherin expression

1.2 周细胞在脊髓损伤后血脊屏障修复的调控作用

脊髓神经血管单元是由内皮细胞、基底膜、周细胞、胶质细胞以及相邻神经元等共同构成，是维持血脊屏障的最基本结构[18]。血脊屏障是血液循环与神经组织之间高度功能化的神经血管系统结构，具有独特特征，在微环境的高度精确控制中发挥重要作用(Fig.2)。脊髓损伤是中枢神经系统(central nervous system, CNS)急性创伤之一，通常导致患者终身残疾，并伴随着血脊屏障的破坏。血脊屏障的破坏促进巨噬细胞浸润，周细胞、紧密连接(tight junctions, TJ)蛋白和粘连连接(adherens junctions, AJ)蛋白的丢失，使炎症细胞进入受伤部位，造成脊髓损伤继发性损伤，最终导致永久性神经功能障碍[19]。

Fig.2 Effect of spinal cord injury on blood-spinal cord barrier permeability The blood-spinal cord barrier (BSCB) includes vascular endothelial cells, vascular basement membrane and pericytes. Spinal cord injury (SCI) is accompanied with BSCB destruction, which induces the infiltration of macrophages and the loss of pericytes, tight junctions (TJ) and adherens junctions (AJ) proteins

周细胞是血脊屏障的重要组成成分，有收缩血管、免疫和迁移等功能，并且周细胞拥有干细胞分化潜能，在脊髓损伤后血脊屏障功能的维持和血管再生中发挥重要作用[7]。周细胞不仅能通过自身收缩和免疫作用参与调控血管内血液流动，而且会抑制一些大的血浆蛋白质通过转胞吞作用穿过血脊屏障，从而促进内皮细胞增殖与分化，防止血管畸形发生[20]。在脊髓损伤大鼠模型中发现，周细胞在调节损伤部位以下脊髓的毛细血管张力和血流方面发挥关键作用[7]。CNS中的血管受神经元活动的控制，脊髓损伤会导致毛细血管张力过高、血流不畅和缺氧等状态[7, 21]。脊髓损伤后，周细胞过度表达芳香族L-氨基酸脱羧酶(asearomatic L-amino acid decarboxylase, AADC)；这些胺与周细胞上的受体结合并活化，诱导局部血管收缩，减少血流量，导致组织缺血[7]。由以上分析可知，维持周细胞正常功能是脊髓损伤后维持内环境稳定的重要因素。

目前，干细胞移植是脊髓损伤修复领域的研究热点。血脊屏障含有丰富的具有干细胞特性的周细胞，可以分泌大量外泌体参与调控血脊屏障的完整性[22]。在血脊屏障中，周细胞与内皮细胞联系密切。脊髓损伤后，周细胞来源的外泌体可提高内皮细胞调节血流能力，保护血脊屏障，减轻水肿，降低缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)，Bax，水通道蛋白-4(aquaporin-4, AQP4)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP2)等蛋白质的表达水平，抑制细胞凋亡，从而有效缓解脊髓损伤后的病理改变，改善运动功能[22]。体外研究进一步证明，周细胞分泌的外泌体能抑制缺氧条件下内皮细胞磷酸酶和张力蛋白同系物(phosphatase and tensin homolog, PTEN)的表达，激活PI3K/AKT信号通路[22]。以上研究表明，在脊髓损伤后，保护周细胞对血脊屏障完整性具有重要意义。

2 糖尿病对血管病变的影响及作用机制

2.1 糖尿病调控血管病变的分子机制

糖尿病是心血管疾病发病的重要风险因素，可诱导冠状动脉闭塞、高血压、动脉粥样硬化和视网膜病变等并发症。在糖尿病患者和模型动物的动脉中均发现内皮依赖性血管舒张功能受损[23]。糖尿病所诱导的心脑血管疾病是由错综复杂的分子机制协同调控，包括全身或局部产生的炎症反应、细胞内应激作用和细胞死亡等。

2.1.1 炎症反应与糖尿病血管性疾病 糖尿病与炎症反应密切相关。炎症反应可导致2型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)的发生，而在高血糖情况下，炎症反应又会加剧，从而促进糖尿病及其并发症的发生发展，介导血管功能障碍和终末器官损伤等疾病[24]。在T2D大鼠的血管组织中观察到剧烈炎症反应，表现为核因子кB(nuclear factor kappa B, NF-кB)活性增加、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)和细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule, ICAM-1)上调以及髓过氧化物酶活性增强[25]。在高血糖诱导血管损伤过程中，NF-кB是血管发生氧化应激作用和炎症反应之间的重要媒介[26]。高血糖诱导内皮细胞产生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)，从而激活NF-кB转录活性，进一步促进炎症反应。NF-кB激活似乎是血管炎症反应中的一个初始信号，NF-кB靶向调控的许多基因表达产物(例如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、TNF-α和白细胞介素-1β(interleukin-1 β, IL-1β))反过来激活这一因子，形成一个正反馈循环[27]。在不同的糖尿病动物模型均检测到血管内NF-кB过度激活，抑制NF-кB可缓解血管炎症，改善血管功能[28]。因此，靶定炎症反应可能是糖尿病诱导的血管性疾病的有效治疗策略。

2.1.2 氧化应激与糖尿病血管性疾病 氧化应激在糖尿病血管细胞损伤中发挥重要作用。高血糖增加线粒体电子传递链生产的O2·-，而过度生产的超氧化物进一步通过以下途径，包括蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)、糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)、己醣胺通路、DNA，蛋白质和脂类损伤，引起血管细胞损伤[27,29]。此外，糖尿病环境也可以通过多种途径产生超氧化物，包括激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NAD(P)H)氧化酶活性，增强AGEs信号，血管紧张素II(angiotensin II, AT-II)和氧化的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)受体。已有研究证实，核因子E2相关因子2 (nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)在糖尿病大鼠血管中的表达减少，Nrf2激动剂可防止糖尿病大鼠主动脉结构改变和血管炎症[28]。此外，妊娠期糖尿病通过诱导Nrf2过表达来应对脂质过氧化物的暴露，从而调控氧化应激水平[30]。因此，有人提出，高血糖诱导内皮细胞中Nrf2通路失活会导致内皮功能障碍和糖尿病并发症的发展[31]。此外，成纤维细胞生长因子1(fibroblast growth factor 1, FGF1) 也被报道，其可以通过调控Wnt/β-catenin/c-Myc轴介导的己糖激酶2(hexokinase 2, HXK2)，抑制线粒体中超氧化物生成，发挥保护内皮细胞的功能[32]。

2.1.3 细胞焦亡与糖尿病血管性疾病 细胞焦亡是一种伴随着炎症反应的程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)方式[33]。细胞焦亡由各种病理因素刺激(例如氧化应激、高血糖和炎症)触发，其特征是质膜快速剥离，随后释放细胞内容物和促炎介质，包括IL-1β和白介素-18(interleukin-18, IL-18)[34]。细胞焦亡包括胱天蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1, caspase-1)依赖的常规途径和涉及胱天蛋白酶-4，5(人)和胱天蛋白酶-11(小鼠)的非常规途径[35]。目前，在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞等细胞中都观察到细胞焦亡现象[36]。细胞焦亡参与调控多种心血管疾病(例如心肌梗死和心肌病变)致病过程。糖尿病患者中机体高血糖可促进细胞焦亡，抑制视网膜色素上皮细胞增殖[37]。在糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)模型大鼠的血清中发现趋化素、趋化因子样受体1(chemokine-like receptor 1, CMKLR1)、NLRP3、胱天蛋白酶-1前体、活化胱天蛋白酶-1和成熟IL-1β的表达均显著增加[38]。因此，缓解细胞焦亡在糖尿病血管性疾病治疗中具有极大前景。

2.1.4 铁死亡与糖尿病血管性疾病 铁死亡是一种全新的细胞死亡方式，具有独特的形态结构、生物化学及遗传学表观。铁死亡的本质是铁离子依赖的脂质过氧化产物超量蓄积引起的以线粒体改变为主的氧化损伤。2012年，将Erastin诱导的具有自己独特形态学、基因学、生物化学特征的细胞死亡方式正式命名为铁死亡[39]。在形态学方面，铁死亡主要表现为线粒体膜固缩，膜密度增加，线粒体嵴模糊不清、减少或消失，细胞核膜完整；在生化方面，表现为铁离子水平升高，产生大量ROS，谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPx4)活性下降和脂质代谢产物堆积[39]。目前，有研究发现，糖尿病可以通过介导内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)诱导铁死亡，从而加重缺血性心肌病[40]。二甲双胍通过抗铁死亡作用缓解高脂血症诱导的血管钙化[41]。去铁胺治疗可抑制内皮细胞铁死亡，从而抑制中风后血管退化，促进神经血管单元重构，从而改善T2D雄性大鼠的认知功能[42]。心肌细胞中混合谱系激酶3(mixed lineage kinase 3, MLK3)信号诱导的铁死亡，是压力超负荷反应诱导的不良心肌纤维化的重要诱导因素。MLK3不仅可调节NF-κB/NLRP3信号通路介导的炎症反应；而且可以调节c-Jun N末端激酶(c-Jun n-terminal kinase, JNK)/p53信号通路介导的氧化应激，促进铁死亡，协同诱导心肌纤维化[43]。这些研究结果表明，铁死亡是糖尿病诱导心血管疾病过程中的重要机制。

2.2 糖尿病对血管性疾病中周细胞的调控作用

微脉管系统和组织元素之间的动态交互是调节体内平衡的重要方式。代谢异常是引起微血管功能障碍的重要因素。有报道指出，T2D大鼠在急性压力升高和认知损伤后出现BBB渗漏大量增加，这与肌源性反应和脑血流(cerebral blood flow, CBF)自动调节降低、神经血管解偶联、内皮紧密连接降低和毛细血管中的周细胞覆盖率减少息息相关[44]。周细胞表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)，参与调节大脑小动脉血管收缩[45]。有研究证实，老年糖尿病大鼠BBB通透性增强可能与高糖环境下，周细胞中ROS生成增强和线粒体中ATP形成减少，从而导致表达α-SMA的周细胞收缩能力丧失有关[46]。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常见的微血管并发症[47,48]。值得注意的是，视网膜毛细血管周细胞覆盖率明显大于其它毛细血管。周细胞变性被认为是糖尿病致视网膜血管功能障碍的早期标志[49]。糖尿病可以导致视网膜周细胞丢失从而影响毛细血管重构，并降低糖尿病患者内皮细胞的生存[50]。此外，糖尿病可诱导周细胞分泌基因组谱的改变[51]。综上所述，糖尿病介导的周细胞损伤是血管性疾病的重要诱导因素。

3 糖尿病介导的周细胞损伤对脊髓损伤后血脊屏障修复的影响

3.1 糖尿病对脊髓损伤修复的影响

糖尿病与脊髓损伤密切相关。已有研究证实，相比正常人，糖尿病患者更容易诱发脊髓损伤[52]；而脊髓损伤患者由于运动能力下降，能量消耗减少，也更易发展为肥胖、高血糖、高血脂和胰岛素抵抗等糖尿病症状，概率高达13%～20%[52,53]。在T2D小鼠中发现，小鼠有明显的高血糖和肥胖症状，长期机械性全麻，并且脊髓中趋化因子配体13(chemokine ligand 13, CXCL13)、趋化因子受体5(chemokine receptor 5, CXCR5)和促炎细胞因子(TNF-α和IL-6)等表达量显著增加[54]。此外，在db/db小鼠的脊髓组织中存在胶质增生和细胞信号激酶的磷酸化水平(p-ERK、p-AKT和p-STAT3等)显著上调的现象[54]。因此，随着糖尿病患者逐渐增多，糖尿病合并脊髓损伤患者和脊髓损伤诱发急性高血糖的患者也在日益增加。

脊髓损伤后的继发性损伤可引起一系列复杂的分子事件，包括离子稳态、局部水肿、局部缺血、局灶性出血、细胞凋亡、氧化应激和炎症紊乱等。继发性反应是导致脊髓损伤运动功能恢复延迟的重要原因。其中，炎症反应[55]、星形胶质细胞增生[56]和神经元丢失[57]是脊髓损伤与神经损伤的3个常用指标。研究发现，糖尿病会降低神经元存活率，促进星形胶质细胞增殖，增加炎症细胞浸润并阻碍脊髓损伤后运动功能恢复[58]。细胞凋亡是糖尿病诱导并发症的主要机制[59, 60]。糖尿病通过激活细胞凋亡和自噬作用机制，促进神经元凋亡，加重脊髓损伤后的神经功能损伤[58]。Kobayakawa等[61]研究也证实，机体高血糖可激活小胶质细胞，促进NF-κB转入细胞核中，从而促进TNF-α和1 L-6等炎症因子的表达，进而介导神经元凋亡，加重脊髓损伤；胰岛素治疗可缓解高糖对脊髓损伤修复的不良影响。临床试验也进一步证实，糖尿病不利于脊髓损伤患者运动功能的恢复。

3.2 糖尿病介导的周细胞损伤对脊髓损伤血脊屏障修复的影响

血管功能障碍是糖尿病最早、最根本的病理改变。糖尿病诱导的血管并发症是目前临床实践面临的一个严峻挑战。脊髓损伤后，血脊屏障破坏会加速神经系统中有害血液衍生成分的聚集，从而导致继发性神经退行性损害[62]。周细胞是血脊屏障的重要细胞成分，在血脊屏障功能的维持和血管再生中发挥重要作用。脊髓损伤后周细胞覆盖率显著降低[63]。那么，糖尿病是否通过介导周细胞损伤调控脊髓损伤后血脊屏障修复？有研究报道，糖尿病不仅能改变周细胞收缩表型和细胞骨架信号传导[64]，而且糖尿病诱导周细胞的分泌基因组谱改变[51]，影响周细胞正常修复功能。He等[62]研究发现，与单纯的脊髓损伤大鼠相比，糖尿病合并脊髓损伤大鼠损伤后第1 d就出现伊文思蓝渗透增加，血脊屏障破坏更为严重，血管内皮细胞和周细胞减少。内质网应激是主要的分子机制；内质网应激抑制剂能够显著减少伊文思蓝渗透，缓解血管内皮细胞和周细胞损伤。该研究表明，糖尿病可以通过调控内质网应激介导周细胞的丢失，从而加重糖尿病合并脊髓损伤大鼠血脊屏障的破坏，抑制脊髓损伤运动功能恢复。由上可知，糖尿病介导的周细胞损伤是影响脊髓损伤后血脊屏障修复的重要因素。

4 问题与展望

随着糖尿病患病人数急剧增加，糖尿病诱导的神经损伤已受到广泛关注。在该综述中，我们系统阐述了糖尿病通过抑制脊髓损伤后血脊屏障修复，阻碍运动功能修复的过程。其中，糖尿病介导的周细胞损伤是血脊屏障损伤的重要影响因素之一。因此，保护血脊屏障中的周细胞免受损伤可能是临床上治疗糖尿病合并脊髓损伤的重要策略。但是，糖尿病合并脊髓损伤夹杂着糖尿病和脊髓损伤这两种复杂的生物学变化。机体内的调控网络相当复杂，当前的机制研究只是冰山一角。因此，未来的研究工作需要进一步深入探究相关机制，完善糖尿病合并脊髓损伤致病的理论基础，寻找重要靶点，为临床上精准治疗糖尿病合并脊髓损伤提供新的理论指导。