做客肿瘤细胞的免疫检查点分子：不在其位，也谋其政

闫晓俊， 王冬来

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学遗传学系， 北京 100005)

“橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳”。宏观事物的发展固然有赖于其所处的环境，而微观分子的生物学功能也不乏取决于其所在的细胞“土壤”。免疫检查点(immune checkpoint)本是一类表达在免疫细胞表面的抑制性分子，对于自身免疫耐受的建立、防止免疫反应的过度激活、维持生理条件下免疫系统的稳态发挥重要的作用。应用单克隆抗体靶向免疫检查点的免疫疗法业已在多种进展期肿瘤治疗中取得了瞩目的成就[1, 2]。有趣的是，近年的研究显示，一些关键的免疫检查点分子，例如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PD-1)，在某些类型的肿瘤细胞中也存在表达；而这些表达在肿瘤细胞中的免疫检查点分子，被称为“肿瘤细胞固有免疫检查点分子(cancer cell-intrinsic immune checkpoint molecules)”。名虽相似，质却不同：由于离开了免疫细胞的“土壤”，这些分子显然不再具备传统意义上“免疫检查点”的功能；然而，这些“异位”表达的检查点分子可以对肿瘤细胞自身的生物学行为或者微环境中肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用产生复杂的影响。因此，这一现象的发现拓展了免疫检查点分子研究的范畴，推动了免疫检查点分子在肿瘤细胞中生物学功能和分子调控机制的新探索和再认识，为制定基于靶向免疫检查点分子的肿瘤精准干预策略提供了新的思路。本文对肿瘤细胞固有免疫检查点分子的研究脉络作一梳理，并以CTLA-4和PD-1为例，阐述肿瘤细胞固有免疫检查点分子的功能和调控机制，最后对肿瘤细胞固有免疫检查点分子的研究前景作一展望。

1 肿瘤细胞固有免疫检查点分子研究的主要脉络

在过去十余年中，领域内对肿瘤细胞固有免疫检查点分子的认识经历了从慢到快的过程。早在2005年，就在多种类型的实体瘤中检测到CTLA-4转录本，但彼时其在肿瘤细胞中表达的意义尚不明确[3]；直到2012年的一项临床相关性研究，发现CTLA-4高表达的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者死亡率较低，推测这一现象可能由于高表达CTLA-4的肿瘤细胞与肺癌组织中表达CTLA-4配体的细胞相互作用，进而导致肿瘤细胞的死亡。这一研究首次将肿瘤细胞固有CTLA-4表达与肿瘤的预后进行联系，提示肿瘤细胞固有CTLA-4的表达及其调控具有重要的生物学意义[4]。值得注意的是，不同类型的肿瘤细胞中CTLA-4表达的结果及调控机制可能完全不同[5, 6]。肿瘤细胞固有PD-1的发现源于2010年一项对致瘤性ABCB5+黑色素瘤(melanoma)细胞亚群的研究[7]。在此基础上，后续的研究在2015年证实，在不同黑色素瘤细胞亚群及多个黑色素瘤细胞系中均存在PD-1的表达；更为重要的是，该研究首次提出了黑色素瘤细胞固有PD-1的表达，可通过获得性免疫反应非依赖的方式促进肿瘤的发生发展[8]。在当时，靶向PD-1的基础研究和临床实验如火如荼的大背景下，这一发现无疑起到里程碑式的作用，直接推动了肿瘤细胞固有免疫检查点分子、特别是肿瘤细胞固有PD-1的研究。目前，在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)、胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)、非小细胞肺癌中均发现肿瘤固有PD-1的表达，并且以不同方式调控肿瘤细胞的命运[9-11]。除了CTLA-4和PD-1，其他免疫检查点分子包括淋巴细胞激活基因3(lymphocyte activation gene 3, LAG3)、T细胞免疫球蛋白3(T-cell immunoglobulin 3, TIM3)、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(T-cell immunoglobulin and ITIM domain, TIGIT)在肿瘤细胞中的表达和功能近年来也陆续被报道[12-14]，进一步丰富了肿瘤细胞固有免疫检查点分子的研究内容和理论体系。近年，还将目光聚焦到肿瘤细胞固有免疫检查点分子的调控机制方面。例如，在转录水平发现了抑癌蛋白p53调控肺癌细胞中PD-1表达的分子机制[15]；在转录后水平发现了RNA去甲基化酶肪量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein, FTO)调控黑色素瘤细胞中PD-1 mRNA稳定性的分子机制[16](Fig.1)。

Fig.1 The timeline and the milestones of the studies on cancer cell-intrinsic immune checkpoint molecules

2 肿瘤细胞固有免疫检查点分子的功能和调控机制

2.1 CTLA-4

CTLA-4是早期发现的可表达在肿瘤细胞的免疫检查点分子。CTLA-4主要表达在T细胞表面，属于CD28免疫球蛋白家族成员[17]。当它以“免疫检查点”的身份工作时，CTLA-4主要作为T细胞表面的免疫抑制性受体，与抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APCs)表面的CD80或CD86配体分子结合，向T细胞传递抑制性信号，负性调控T细胞的激活[18]。其中，调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)表面高表达CTLA-4分子，通过竞争性结合APCs表面的CD80或CD86分子，抑制APCs的功能，进而阻碍其他类型T细胞，例如细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)的激活，最终抑制肿瘤免疫[19]。Ipilimumab是第一个被美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)批准的靶向CTLA-4的单克隆抗体，目前已用于治疗皮肤黑色素瘤、肾细胞癌和转移性结肠直肠癌等[20]。近年来，研发了一些新的靶向CTLA-4的抗体，例如Tremelimumab和Quavonlimab，已经进入晚期黑色素瘤和NSCLC治疗临床实验阶段[21, 22]。

而作为“肿瘤细胞固有免疫检查点分子”登场的CTLA-4，已被发现表达在多种人类恶性实体瘤(例如黑色素瘤、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤等)或其来源细胞系中[3]。应用重组的CTLA-4配体CD80或CD86处理CTLA-4阳性的肿瘤细胞可诱导细胞凋亡，提示除了“耗竭”T细胞以外，CTLA-4还能通过肿瘤细胞内途径调节肿瘤细胞的命运[3]。研究发现，在部分NSCLC患者癌细胞中，存在CTLA-4的高表达；且在缺乏获得性免疫的条件下，使用抗CTLA-4抗体可以促进NSCLC细胞的体外增殖和体内成瘤[4, 5]。这一发现表明，肿瘤细胞固有CTLA-4的表达直接参与调控肿瘤细胞自身的生物学行为。进一步研究发现，应用抗CTLA-4抗体可激活表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)信号通路，并诱导肿瘤细胞表达程序性死亡蛋白配体1(programmed death ligand 1, PD-L1)，这也部分解释为何在缺乏获得性免疫的条件下，使用抗CTLA-4抗体会“出人意料”的促进肿瘤的进展[5]。上述研究提示，在获得性免疫存在的条件下，联合靶向CTLA-4和PD-1/PD-L1可能会产生“1+1>2”的效果。例如，在抗PD-1/PD-L1免疫治疗失败的黑色素瘤患者中，同时给予抗CTLA-4抗体Ipilimumab和抗PD-1抗体Pembrolizumab的治疗效果要优于单独给予抗PD-1/PD-L1的治疗[23]。这可能是由于抗CTLA-4抗体的治疗上调了肿瘤细胞PD-L1的表达，进而增强了抗PD-1/PD-L1治疗的敏感性。

通过对肿瘤细胞系百科全书(Cancer Cell Line Encyclopedia, CCLE)大数据的分析发现，肿瘤细胞固有CTLA-4在功能上可能作为肿瘤抑制因子发挥作用[24]。然而具体到个例，情况却不尽相同。例如，在一项针对黑色素瘤干细胞(melanoma stem cell)研究中发现，其固有表达的CTLA-4可诱导肿瘤细胞的增殖并抑制肿瘤细胞的凋亡[6]。此外，有meta分析表明，肿瘤微环境中CTLA-4表达与乳腺癌患者预后差密切相关[25]。目前，对于调控CTLA-4的分子机制报道较少，且主要基于对免疫细胞的研究。例如，在滤泡辅助性T细胞(T follicular helper, Tfh)中，转录因子TCF1(transcription factor T cell factor 1)的HDAC(histone deacetylase)结构域突变能促进CTLA-4表达[26]。表观遗传机制，例如DNA甲基化修饰也可调控CTLA-4的表达[27]；一项基于黑色素瘤患者的研究发现，CTLA-4启动子区DNA甲基化的水平可以作为预测抗CTLA-4抗体治疗敏感性的生物标志物[28]。虽然目前对肿瘤细胞是否存在特异性调控CTLA-4表达的分子机制仍不甚清楚，已有的研究初步表明，肿瘤细胞固有CTLA-4的功能在不同类型的肿瘤细胞中存在异质性，因此，应用多种肿瘤系统或模型来探索肿瘤细胞固有CTLA-4的调控机制和分子功能网络是十分必要的。

2.2 PD-1

PD-1是近年来发现的可表达在多种肿瘤细胞上的免疫检查点分子，与肿瘤患者的预后密切相关[29]。PD-1，又称CD279，于1992年首次在白细胞介素3(interleukin 3, IL-3)缺乏的小鼠造血祖细胞系LyD9和小鼠杂交瘤细胞系2B 4-11中被鉴定[30]。作为“免疫检查点”的PD-1分子主要表达在外周激活的T细胞表面；其他种类的免疫细胞，例如B细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和中央树突状细胞也存在PD-1的表达[31]。当表达在T细胞表面的PD-1与表达在肿瘤细胞或抗原递呈细胞表面的受体分子PD-L1或PD-L2结合时，可抑制T细胞受体(T-cell receptor, TCR)下游的信号传导，进而抑制T细胞的功能[32]。

肿瘤细胞固有PD-1的表达最早在黑色素瘤患者的肿瘤细胞中发现[7]。值得注意的是，PD-1的表达主要存在于ABCB5阳性的恶性黑色素瘤起始细胞(malignant melanoma initiating cells, MMICs)，而非组织中所有的肿瘤细胞[7]。这种肿瘤细胞“非均一”的PD-1表达模式也在后来的研究中被进一步证实：(1)只有约60%的黑色素瘤样本中组织活检存在肿瘤细胞固有PD-1的表达；(2)只有部分黑色素瘤细胞系中的部分细胞亚群存在PD-1的表达[8]。在小鼠来源的黑色素瘤细胞系B16F0或B16F10中过表达外源PD-1会显著促进上述细胞系形成肿瘤的能力，而敲减肿瘤细胞固有PD-1或使用抗PD-1抗体封闭肿瘤细胞固有PD-1则会抑制肿瘤的形成[8, 33]。重要的是，这种PD-1对黑色素瘤细胞系成瘤能力的改变无论在正常的受体小鼠还是在免疫缺陷的受体小鼠中均可被稳定观察到。这一发现的意义在于，揭示了肿瘤细胞固有PD-1可以通过“获得性免疫非依赖”这一途径，调节肿瘤细胞自身的生物学行为，并可能以此为基础在靶向PD-1的肿瘤免疫治疗中发挥重要的调控作用。由于微环境中的黑色素瘤细胞或其他浸润细胞存在PD-L1的表达，肿瘤细胞表面的PD-1与自身或邻近细胞表面的PD-L1相结合，激活了肿瘤细胞内mTOR信号通路下游效应子核糖体蛋白S6(ribosomal protein S6, RPS6)的磷酸化，进而促进细胞的增殖和肿瘤的形成[8](Fig. 2A)。尽管这是一种合理的解释，但是由于RPS6是许多上游信号的效应分子，因此，肿瘤细胞固有PD-1有可能还受到其他信号通路或分子机制的调控。

在肝细胞癌和胰腺导管腺癌细胞中也存在PD-1的表达，并且在功能上同样可以通过“获得性免疫非依赖”的方式促进肿瘤的发生[9, 10]，但二者的机制不尽相同。在肝癌细胞中，PD-1直接结合mTOR通路下游的真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E, eIF4E)和RPS6，通过促进二者的磷酸化修饰激活促增殖效应(Fig. 2B)。在动物模型中，联合应用mTOR抑制剂和抗PD-1抗体对抑制肝癌细胞成瘤的作用优于二者单独使用，表现出显著的协同效应[9]。在胰腺导管腺癌组织和细胞系中，均检测到PD-1的表达，且肿瘤组织中PD-1的表达水平与生存期成负相关，提示肿瘤细胞固有PD-1与胰腺导管腺癌的预后相关。胰腺导管腺癌细胞中PD-1与MOB1(mps one binder 1)结合，并抑制其磷酸化、激活Hippo信号通路下游靶基因CYR61(cysteine-rich angiogenic inducer 61)和CTGF(connective tissue growth factor)，进而促进细胞增殖、抑制细胞凋亡(Fig. 2C)。研究同样发现，使用Hippo通路抑制剂联合PD-1阻断治疗的策略，在抑制胰腺癌细胞成瘤方面优于二者单独使用，这也提示，干预肿瘤细胞固有PD-1及其调控网络对于肿瘤的免疫治疗可能发挥有益的作用[10]。尽管在不同类型的肿瘤或不同特点的肿瘤微环境中，使用同样的策略会得到不同的结果。

2018年，1个病例研究报道了1例非小细胞肺癌细胞患者，在放疗联合抗PD-1抗体治疗后不但未能使肿瘤消退，反而促进了肿瘤的进展[11]。病理检查证实，该患者的肿瘤细胞存在PD-1的表达，推测可能由于抗PD-1抗体封闭了肿瘤细胞固有PD-1而导致了肿瘤的进展。这一推测在小鼠模型上得到了证实：在表达PD-1的小鼠肺癌细胞系M109中，敲减PD-1或使用抗PD-1抗体封闭肿瘤细胞PD-1能显著促进肿瘤细胞的活性，而过表达PD-1则起到相反的作用。重要的是，在免疫缺陷小鼠的荷瘤实验中，发现给予抗PD-1抗体治疗加速肿瘤的生长、抑制肿瘤的凋亡。这一发现与上述肺癌病例的情况高度相似，提示在非小细胞肺癌中固有表达的PD-1能通过“免疫非依赖”的方式抑制肿瘤的进展，发挥类似“肿瘤抑制因子”的作用。与M109细胞中观察结果一致的是，在人源非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299或Calu-1中过表达PD-1，也观察到体外细胞增殖、克隆形成以及体内细胞成瘤能力的降低[34]。给予接种了NCI-H1299细胞的免疫缺陷小鼠以抗PD-1抗体处理，显著促进肿瘤的生长，进一步证明了“封闭”非小细胞肺癌细胞固有PD-1不利于肿瘤的治疗。究其背后的分子机制，可能是由于抗体-PD-1的相互作用激活了肿瘤细胞内部AKT(protein kinase B, PKB)、mTOR、ERK(extracellular regulated protein kinases)等信号通路(Fig. 2 D)。除此之外，在小细胞肺癌[35]、胃癌[36]、鼻咽癌[37]、骨肉瘤[38]和急性淋巴细胞白血病[39]中也检测到肿瘤细胞固有PD-1的表达，但其对肿瘤细胞生物学行为的影响仍有待进一步探索和证实。

Fig.2 The signaling pathways and biological functions of cancer cell-intrinsic PD-1 (A) Melanoma-expressing PD-1 promotes tumor progression by activating phospho-RPS6. (B) PDAC-intrinsic PD-1 coordinates with MOB1 and the hippo pathway to promote tumor progression. (C) In HCC cells, PD-1 employs eIF4E and RPS6, the key downstream substrates of the mTOR pathway, to facilitate tumor progression. (D) NSCLC-intrinsic PD-1 suppresses tumor growth by inhibiting AKT, mTOR and ERK pathways

尽管在免疫细胞中调控作为“免疫检查点”的PD-1的分子机制已研究得较为透彻[40, 41]，但肿瘤细胞如何在各个水平调控PD-1的表达仍远不清楚。考虑到去分化的肿瘤细胞与特化的免疫细胞存在明显的异质性，因此，肿瘤细胞内部和甚至不同肿瘤类型之间，很可能存在特异性的调控PD-1的分子机制。例如，真核信使RNA(messenger RNA，mRNA)最显著的化学修饰——m6A甲基化，在转录后水平调控黑色素瘤细胞中PD-1 mRNA的水平[16]。m6A去甲化酶FTO调控PD-1 mRNA的衰减；敲低FTO增加关键促瘤基因的 m6A 甲基化水平，被m6A 甲基化“阅读器(reader)”——YTHDF2识别后促进PD-1 mRNA降解，从而增加黑色素瘤细胞抗PD-1治疗的敏感性(Fig. 3)。在肺腺癌中发现，小RNA miR-33a与PD-1和PD-L1 mRNA的3′UTR结合，从而在转录后水平下调这2个基因的表达[42](Fig. 3)。我们近期的研究发现，在包括肺腺癌、骨肉瘤、黑色素瘤、胰腺导管癌来源的肿瘤细胞系中，存在抑癌蛋白p53依赖的PD-1的转录激活[15]。在这个过程中，由乙酰基转移酶p300、CBP和TIP60介导的在p53第120位和164位赖氨酸残基的乙酰化修饰起发挥了关键的作用(Fig. 3)。我们的研究同样发现，在肺腺癌细胞系NCI-H1299表达外源PD-1可诱导“免疫非依赖”的肿瘤抑制效应；更为重要的是，抑制该细胞内源性PD-1的表达显著抑制p53依赖的肿瘤抑制效果。应用组蛋白去乙酰基酶抑制剂可明显上调乙酰化p53依赖的PD-1的表达，通过激活p53-PD-1轴发挥抑制肿瘤的作用。

Fig.3 The mechanistic profiles of how PD-1 is regulated in cancer cells The acetylated p53 catalyzed by p300, CBP and TIP60 is a master regulator that transcriptionally activates PD-1 expression in the nucleus, while the downregulation of PD-1 can be achieved by miR-33a and the m6A methylation-mediated mRNA decay mechanisms

综上所述，肿瘤细胞固有PD-1的表达在不同类型的肿瘤中存在明显差异，且可以通过影响肿瘤免疫或通过“获得性免疫非依赖”的方式调控肿瘤微环境或肿瘤细胞自身的生物学行为，最终展现出不同的生物学意义。这些现象的背后，是肿瘤细胞内部复杂的调控PD-1的分子机制及控制网络，也有待未来的工作中进一步研究。

2.3 其它肿瘤细胞固有免疫检查点分子

除了CTLA-4和PD-1，近年陆续发现了在肿瘤细胞表达的其它免疫检查点分子，例如LAG3、TIM3和TIGIT。LAG3主要在肾透明细胞癌中表达[12]。肝癌细胞中表达的TIM3可激活NF-κB(nuclear factor-k-gene binding)信号通路，进而刺激白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)分泌和STAT3磷酸化，促进肿瘤的发生发展。这提示阻断肿瘤细胞固有TIM3可能促进抗TIM3抗体治疗的效果。最近，肿瘤细胞固有TIM3的“异位”表达被认为是结肠癌、肾癌、肺癌、宫颈癌和前列腺癌的独立预后指标，TIM3高表达通过促进肿瘤增殖和代谢等机制，与肿瘤患者的低生存率相关[13, 43]。肿瘤细胞固有TIGIT主要发现表达在结直肠癌细胞中，具有促进肿瘤生长的作用；其分子机制主要是通过抑制NK细胞和CD8+T细胞的功能来实现[14]。目前，对这些免疫检查点分子在肿瘤细胞中的调控机制研究的仍较少。另有报道，在黑色素瘤细胞系A375中，DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5-azacytidine)上调LAG3的mRNA水平，提示LAG3的甲基化水平可能作为预测抗LAG3免疫检查点阻断治疗反应性的生物标志物[44]。最近，一些新的免疫检查点分子，例如B7-H4(B7 homolog 4)，4-1BB (CD137，tumor necrosis factor receptor superfamily 9)，HVEM(herpes virus entry mediator)和GITR(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor-related protein)在肿瘤微环境中被陆续发现[45]，它们是否在肿瘤细胞中表达及发挥生物学功能尚有待研究。

3 问题与展望

肿瘤细胞固有免疫检查点分子的研究方兴未艾。随着一系列关键免疫检查点分子,例如CTLA-4、PD-1的表达在越来越多的肿瘤细胞中被发现，领域内逐渐认识到这些“不在其位，也谋其政”的检查点分子在功能上存在复杂性和异质性，在调控上也很可能存在相对性和特异性。对于肿瘤细胞固有免疫检查点分子的研究，有益于人们从“肿瘤细胞”的角度认识肿瘤微环境中肿瘤细胞与免疫细胞的“博弈”。对于这些“异位”检查点分子在功能上的再认识，将有助于辅助临床设计合理的和个体化的免疫治疗策略，分清“敌军”、“友军”，提高“歼敌效率”，避免“脱靶”或“误伤”。此外，理清肿瘤细胞固有免疫检查点分子在各个层次的调控机制，有利于人们开发新的或联合的肿瘤干预策略，在传统靶向“免疫检查点”治疗的基础上，进一步丰富对抗肿瘤的“武器库”。

值得注意的是，肿瘤细胞中一些免疫检查点分子的表达水平较低，需要使用高效的抗体或敏感的实验方法进行研究。其次，免疫检查点分子多是糖蛋白，肿瘤细胞与免疫细胞之间、不同类型的肿瘤细胞之间，糖基化修饰的酶促反应体系和活性可能存在显著不同。因此，系统鉴定肿瘤细胞中免疫检查点分子的差异性糖基化修饰模式，对于解析肿瘤细胞固有免疫检查点分子的细胞定位、分子功能和调控的生物学过程具有重要意义。此外，由于肿瘤细胞富集的转录因子及蛋白质表达谱与免疫细胞有明显不同，应用高通量的染色质免疫共沉淀-测序(chromatin immunoprecipitation-sequencing, ChIP-seq)、免疫共沉淀-质谱-互作蛋白质组分析(affinity purification-mass spectrometry, AP-MS)等手段，有助于揭示调节肿瘤细胞固有免疫检查点分子表达的关键因子和机制。最后，考虑到肿瘤微环境的复杂性及肿瘤细胞的异质性，应用基于临床或模式动物肿瘤组织的单细胞测序技术，有利于全景式分析和展示肿瘤微环境中免疫细胞、肿瘤细胞乃至间质细胞中免疫检查点分子的表达及功能互作关系，有望为个体化靶向治疗开展提供重要的研究依据。期待不久的将来，随着肿瘤细胞固有免疫检查点分子研究领域出现里程碑式的突破，可以为肿瘤免疫治疗乃至其他肿瘤治疗方法的发展提供新的途径。