基于SSR标记的大明松天然群体遗传多样性分析

罗群凤， 冯源恒， 吴东山， 杨章旗

( 广西壮族自治区林业科学研究院， 国家林业局马尾松工程技术研究中心， 广西马尾松工程技术研究中心， 南宁 530002 )

大明松(var.)为松科(Pinaceae)松属()植物，因1974年首次在广西大明山发现而得名，1975年由中国裸子植物分类学家郑万钧、傅立国等鉴定并发表于《植物分类学报》(郑万钧等，1975)。它是黄山松()在我国西南分布区的一个变种(中国科学院中国植物志编辑委员会，1978；梁盛业，1994)，它们之间的区别在于大明松叶内兼有中生与边生树脂道，而黄山松只有中生树脂道(樊国盛和薛纪如，1993)。大明松主要分布于广西、贵州海拔1 000 m以上的高山，自南向北分别是广西的大明山、大瑶山、银竹老山以及贵州的雷公山、云台山、梵净山、大沙河等地，总体呈不连续点状分布。大明松喜光，适应凉爽、空气湿度较大的高山气候，在土层深厚、排水良好的酸性土及向阳山坡生长良好，耐瘠薄，但生长迟缓。大明松材质坚实，富含树脂，可制作家具、器具、板材等，也可作建筑、矿柱及木纤维工业原料等，为西南高海拔地区重要的用材造林树种，且其树形姿态优美，亦是重要的景观树种。

由于长期被人们忽视，大明松没有被系统地利用与保护，种群分布状况、遗传多样性水平、自然更新能力都缺乏系统、针对性的调查与研究。目前，对大明松的研究报道很少，仅贾婕等(2019)通过比较研究大明松、马尾松、细叶云南松、拉雅松的种实性状，分析了这4种松树的繁育对策及交配系统状况；冯源恒等(2019)对广西和贵州的大明松种质资源进行调查，摸清了黔桂两省(区)大明松种质资源的分布特征，但没有对其群体遗传多样性水平进行分析与评价。因此，亟须对现存的大明松天然群体遗传资源进行多样性研究。

遗传多样性是生物群体长期进化的产物，是其生存适应和发展的前提。遗传多样性越高，遗传变异越丰富，对环境变化的适应能力就越强。因此，对其进行研究有助于生物群体的保护与利用。目前，遗传标记是研究遗传多样性最常用的手段，其中SSR(simple sequence repeat)标记是多态性最高，也是应用最广泛的遗传标记之一。周海兰等(2021)用23对SSR多态性引物对收集的54份油梨种质材料进行PCR扩增，分析了这些种质资源的遗传多样性和亲缘关系；臧明月等(2021)利用SSR分子标记对白栎天然居群进行遗传多样性分析，为其种质资源的合理开发与保护提供指导；陈罡等(2020)利用10对新开发的蒙古栎特异的核SSR分子标记，分析了辽宁省境内分布蒙古栎天然群体的遗传多样性水平；陈林杨等(2020)利用SSR分子标记技术对取自不同地方的35份柚种质资源进行遗传多样性分析，为柚资源的保护、品种鉴定及遗传改良提供借鉴与依据。

鉴于此，本文利用SSR分子标记对大明松天然群体开展遗传多样性研究，分析其多样性水平及遗传分化情况，将有力加强对稀有树种的保护力度，促进生物多样性保护与生态环境建设，为科学利用稀有松类资源打下坚实基础。因此，研究我国黔桂地区大明松天然群体遗传多样性具有重要理论和意义。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料包括3个天然群体，分别为广西大明山群体、贵州梵净山群体、贵州大沙河群体(表1)。其中，大明山群体(DM)取自广西大明山国家级自然保护区仙人台(108°25′54″—108°25′58″ E、23°30′12″—23°30′13″ N)，属南亚热带湿润山地季风气候。无霜期292～312 d，日照时间长，光热充足。夏湿冬干，干冷同期，湿热同季，气候垂直变化明显(冯源恒等，2019)。

表 1 大明松群体样本信息Table 1 Population sample information of Pinus taiwanensis var. damingshanensis

梵净山群体(FJ)取自贵州梵净山国家级自然保护区棉絮岭(108°39′46″—108°39′52″ E、27°54′45″—27°54′46″ N)，属中亚热带湿润山地季风气候。无霜期270～278 d，相对湿度平均达80%(冯源恒等，2019)。

大沙河群体(DS)取自贵州大沙河国家级自然保护区甑子岩(107°35′04″—107°35′09″ E、29°08′13″—29°08′22″ N)，属北亚热带湿润季风气候。大沙河地形北高南低，最高海拔1 939.9 m，最低海拔560 m，平均海拔1 400 m，相对湿度88%(冯源恒等，2019)。

每个群体按照株距30 m，采集30株以上样本。因大明山群体空间较小，仅采集到26株。将采集的针叶装入离心管，填充硅胶进行干燥处理，便于保存。

1.2 方法

1.2.1 大明松DNA提取方法 采用改良的CTAB裂解—硅珠吸附法(Doyle & Doyle，1990)提取大明松针叶DNA并纯化，通过琼脂糖凝胶电泳(1%浓度)抽样检测样本DNA 质量，采用紫外分光光度计测定各样本DNA浓度，稀释至统一浓度后置于-20 ℃环境保存备用。

1.2.2 大明松SSR引物来源及PCR反应条件 研究所使用的SSR引物是根据马尾松基因组DNA 测序所得序列设计开发获得(冯源恒等，2016)，并使用8个大明松DNA样品进行引物筛选，选取主带清晰且有多态性的引物12对，用于本实验的群体遗传多样性研究。引物设计由上海捷瑞基因技术有限公司合成，Taq酶、dNTPs等也购自该公司。

PCR反应体系为10 μL：10 mmol·LpH 8.0Tris-HCI，50 mmol·LKCI，2.5 mmol·LMg，0.2 mmol·LdNTPs，2.5 pmol引物，0.08 U Taq聚合酶，10～20 ng DNA。扩增反应程序：94 ℃4 min；94 ℃15 s，55～60 ℃15 s，72 ℃30 s，25 cycles； 72 ℃延伸20 min结束PCR反应(冯源恒等，2016)。

将PCR扩增产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，并银染检测，实验方法参照杨章旗等(2014)方法进行。

1.2.3 遗传多样性分析 SSR 条带判读参照杨章旗等(2014)方法进行。获得SSR分型数据后，采用POPGENE32软件(Yeh et al., 1997)计算12个位点的下列遗传多样性参数：多态位点百分率(percentage of polymorphic loci，PPL)；多态信息含量(polymorphic information content, PIC)；观察等位基因数(number of observed alleles，)；有效等位基因数(number of effective alleles，)(Hartl et al., 1989)；Shannon’s信息指数(Shannon’s information index，)(Shannon et al., 1949)；观察杂合度(observed heterozygosity，)；期望杂合度(expected heterozygosity，)(Nei et al., 1973)；Nei’s基因多样度()。并基于上述参数进一步计算大明松群体的固定指数()、基因分化系数()和基因流()及遗传距离(genetic distance，GD)。

2 结果与分析

2.1 基于种间通用性的大明松SSR引物筛选

根据引物筛选结果获得用于大明松遗传多样性检测的SSR引物12对。比较这12对引物在大明松和马尾松(冯源恒等，2016)群体间的观察等位基因数可知，大明松有6对引物的等位基因数比马尾松少，有3对引物与马尾松相同，只有3对引物的等位基因数比马尾松多，平均观察等位基因数大明松、马尾松分别为3.08和3.50，说明马尾松在这些位点上具有更为丰富的遗传变异(表2)。

表 2 大明松与马尾松等位基因数比较Table 2 Comparison of allelic number between Pinus taiwanensis var. damingshanensis and P. massoniana

2.2 大明松天然群体遗传多样性分析

由表3可知，12对引物在3个群体94个样本中共检测到等位基因37 个，多态位点百分率为100%。12个SSR位点平均观察等位基因数为3.08，有效等位基因数在1.16 ～2.87之间，平均为1.68，不同位点间有效等位基因数差异较大。观察杂合度的值范围在0.14～0.66之间，平均为0.35；期望杂合度的值在0.12～0.92之间，平均为0.40，不同位点的杂合度也存在较大差异。12个SSR位点Shannon’s信息指数平均为0.62，Nei’s基因多样度平均为0.35。多态信息含量的值在0.13～0.58之间，平均为0.31，最高为PF695位点，最低为PF464位点。

表 3 大明松天然群体的遗传多样性参数Table 3 Genetic diversity parameters of natural populations of Pinus taiwanensis var. damingshanensis

由表4可知，分别统计3 个大明松群体的遗传多样性参数，比较群体间遗传多样性水平。3个群体的观察等位基因数高到低排序为大沙河群体>梵净山群体>大明山群体。而3 个群体的有效等位基因数、期望杂合度、Shannon’s信息指数与Nei’s基因多样度由高到低排序均为大沙河群体>大明山群体>梵净山群体。说明大沙河群体遗传多样性最为丰富，其次为大明山群体，梵净山群体最低。

表 4 大明松天然群体间遗传多样性比较Table 4 Comparison of genetic diversities among natural populations of Pinus taiwanensis var. damingshanensis

2.3 大明松群体遗传结构与基因流分析

大明松群体的种群平均近交系数()为-0.16，复合种群平均近交系数()为-0.26，说明大明松群体偏离哈迪-温伯格平衡，表现出杂合子过剩现象。大明松群体有亲缘关系种群间的平均近交系数()为0.08，群体间不存在明显的遗传分化。基于值计算大明松群体间基因流(gene flow，)，值在不同位点的变化范围为0.43～31.68，平均为2.74，可知大明松3个群体间的基因交流比较充分。

通过分析大明松群体的遗传分化情况可知(表5)，大明松群体内的遗传多样性占87.64%，群体间遗传多样性占12.36%；由基因多样度计算出的群体间的基因分化系数为0.10，而群体内基因多样性比值为0.90。这表明，大明松群体间的遗传分化水平较低，大部分变异均存在群体内。

表 5 大明松群体遗传分化Table 5 Genetic differentiation of Pinus taiwanensis var. damingshanensis

2.4 大明松天然群体遗传距离分析

大明松天然群体间遗传距离(genetic distance，GD<0.077 0)偏小，且大明山和大沙河群体遗传距离相对较近(GD=0.026 9)；群体遗传一致度(genetic identity，GI>0.925 9)较高(表6)。

表 6 群体间的Nei’s遗传距离和遗传一致度Table 6 Nei’s genetic distance and genetic identity between populations

3 讨论与结论

3.1 大明松总体遗传多样性评价

基于12个位点37个等位基因的遗传多样性结果显示，大明松天然群体观察等位基因数在2.33～2.83之间，平均为2.61；观察杂合度和期望杂合度分别介于0.32～0.49、0.28～0.40，平均分别为0.40和0.33；Shannon’s信息指数为0.54，Nei’s基因多样度为0.32。而Al-Rabab′ah和Williams(2002)研究火炬松()的观察等位基因数、观察杂合度、期望杂合度分别为7.75、0.52、0.65，Mehes等(2009)研究白松()时的这三个值分别为6.50、0.72、0.81，Karhu等(2006)研究辐射松()的观察等位基因数、观察杂合度分别为8.19和0.73。与以上同属植物相比较，大明松群体各项指数都较低，遗传多样性水平偏低(表7)。

表 7 松属树种间遗传多样性参数比较Table 7 Comparison of genetic diversity parameters among Pinus species

另外，欧洲云杉()杂合度为 0.79(Pfeiffer et al., 1997)，黄杉()杂合度为 0.67(Amarasinghe et al., 2002)，欧洲栓皮栎()杂合度为 0.65(Hornero et al., 2001)。与以上不同属树种比较，大明松群体杂合度指数也较低。一方面，这可能与大明松片段化的地理分布特点有关。本次调查的3个大明松群体规模均较小，分布范围也相对狭小，不同群体间地理间隔大。因而其遗传变异水平低于火炬松、辐射松等种群规模且大面积连续分布的松类。另一方面，本研究采用的SSR引物是从马尾松基因组中开发的，种间通用性较好的分子标记其所在序列往往较为保守，从而导致标记的多态性较低。

3.2 大明松群体遗传结构特征

研究中发现大明松群体内的遗传变异(87.64%)远远大于群体间的遗传变异(12.36%)，群体间的遗传分化水平偏低，大部分变异均存在于群体内。群体间的基因流平均为2.74，表明3个大明松群体之间基因交流比较充分。由于松树属于风媒传粉，花粉具有很强的远距离散播能力，因此， 远距离地理隔离虽然对大明松群体间的基因交流具有一定的限制作用，但还未导致群体间明显的遗传分化。许玉兰等(2016)对云南松天然群体遗传多样性研究及武文斌等(2018)对油松群体遗传多样性研究时也得出近似结论。由此推论，大明松不同群体间的表型多样性差异在很大程度上是因环境差异而形成，在遗传水平还未发生明显分化。因此，大明松种质资源的选择、收集及保存策略，应以在各群体内选择、保存具有优良性状的单株为主。

研究中还发现大明松群体的观测杂合度大于期望杂合度，表现出杂合子过剩的现象，说明大明松群体可能发生过外来基因的迁入或渐渗。大明松与黄山松一样，都和马尾松是垂直方向的替代种(冯源恒等，2019)。而黄山松与马尾松间存在基因渐渗现象(罗世家等，2001；翟大才等，2018)，因此，大明松极有可能与本区域内马尾松发生基因渐渗。