维生素D在子宫内膜异位症免疫发病机制中的作用研究

韦成厚 韩立薇 张婧 李艳秋 李玉华 聂华

子宫内膜异位症（Endometriosis，EMT）是一种常见的妇科良性疾病，在育龄女性中发病率高达10%～15%[1]。近年来研究发现[2]，EMT 也是一种自身免疫性疾病，是由于免疫细胞平衡失调所致，关于EMT 免疫学方面的研究已成为近年来的研究热点之一。研究发现[3，4]，维生素D 具有调节免疫、抑制炎症、调节血管生成等作用，参与了EMT 的发病过程，维生素D 参与调节体内Th1/Th2/Th17/Treg 的平衡，对限制过度的炎症反应、稳定免疫耐受具有重要的调节作用。Th17 及Treg 细胞是两种重要的CD4+效应T 细胞，在介导EMT 信号通路发生的免疫应答过程中均发挥重要作用[5]。本研究通过临床病例对照分析，旨在探讨维生素D 及Th17/Treg 失衡与EMT 免疫发病机制的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象采用病例对照研究法，选取2021年4～9月于我院妇科行腹腔镜手术的患者，分为两组。观察组（EMT 患者）40 例，平均年龄（30.68±4.19）岁，对照组（输卵管阻塞性不孕患者）40 例，平均年龄（30.08±4.58）岁。观察组纳入标准：①育龄期女性，月经规律，月经周期26～35d；②术前3 个月未接受GnRH-a 或雌孕激素治疗；③未合并子宫腺肌症、子宫肌瘤；④无自身免疫性疾病病史；⑤术中所见且术后病理证实为（单侧或双侧）卵巢型EMT。对照组纳入标准：①育龄期女性，月经规律，月经周期26～35d；②无痛经史及月经异常史；③输卵管阻塞性不孕；④妇科B 超及妇科（宫）腹腔镜检术中所见均不提示子宫肌瘤、子宫腺肌症及EMT；⑤无自身免疫性疾病史。所有入组患者均知情同意，手术时间均选择在月经干净后3～7d 内。本研究已经我院伦理委员会批准，伦审研字[2020]（14）号。

1.2 检测指标检测外周血维生素D 的人体内主要储存形式25（OH）D3浓度，外周血CD4+T 细胞亚群Th17、Treg 细胞浓度，Th17 细胞分泌的IL-17、IL-6 细胞因子浓度，Treg 细胞分泌的IL-10、TGF-β 细胞因子浓度。

1.3 标本的收集及处理晨起抽取空腹外周静脉血5ml，置于10ml 玻璃干燥促凝试管中，室温放置30min 内，然后以高速离心机3 000xg 离心30min，收集上清液存放于无菌的EP 管中，立刻在-80℃冰箱中冻存备用，避免反复冻融循环。

1.4 主要仪器设备及试剂主要试剂盒：Human IL-17 ELISA kit（ab100556，Abcam，The UK）；Human IL-6 ELISA kit（ab178013）；Human IL-10 ELISA kit（ab46034）；Human TGF beta 1 ELISA kit （ab100647）；Human T helper cell 17（TH17） ELISA Kit （MB-4385A；MEIBIAO BIOLOGY，China），Human Regulatory T cells （Treg） ELISA Kit （MB-4243A）和25（OH）D3ELISA Kit （UNEB0049； Reagent Genie，German）。主要设备：酶标仪（Synergy H1；BioTek；the USA），检测波段：450nm。

1.5 检测方法采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预先包被目标因子/细胞检测抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP 标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的目标因子/细胞浓度呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值）并计算样品浓度，计量单位为ng/ml。

1.6 统计学方法运用SPSS 22.0 统计软件进行统计学分析。计量资料数据以±s表示，应用独立样本t检验进行组间比较，检测指标间相关性分析采用Spearman 等级相关分析，相关系数以r来表示。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者各检测指标的表达水平比较观察组患者外周血25（OH）D3、Treg、IL-10、TGF-β 表达水平与对照组比较明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；观察组Th17、IL-17、IL-6 表达水平与对照组比较明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组患者各检测指标的表达水平比较（±s，ng/ml）

表1 两组患者各检测指标的表达水平比较（±s，ng/ml）

组别 例数 25（OH）D3 Th17 Treg IL-17 IL-6 IL-10 TGF-β观察组 40 0.74±0.33 0.07±0.01 0.27±0.11 0.99±0.39 0.36±0.12 0.09±0.02 4.84±2.20对照组 40 0.94±0.43 0.05±0.01 0.34±0.08 0.70±0.20 0.29±0.04 0.12±0.01 6.30±3.31 t-2.287 6.539 -3.420 4.210 3.254 -6.039 -2.326 P 0.025 0.000 0.001 0.000 0.002 0.000 0.023

2.2 观察组患者25（OH）D3和Th17、Treg 及其分泌的细胞因子表达水平的相关性分析观察组患者外周血25（OH）D3与Th17、IL-17、IL-6 的表达水平均呈负相关（r=-0.362、-0.514、-0.571，均P＜0.05），与Treg、IL-10、TGF-β 的表达水平均呈正相关（r=0.683、0.433、0.314，均P＜0.05）。

2.3 对照组患者25（OH）D3和Th17、Treg 及其分泌的细胞因子表达水平的相关性分析对照组患者外周血25（OH）D3与Th17、IL-17、IL-6、IL-10的表达水平均无相关性（r=-0.227、-0.194、-0.005、-0.087，均P＞0.05），与Treg、TGF-β 的表达水平也无相关性（r=0.048、0.112，均P＞0.05）。

3 讨论

EMT 的发病机制至今尚未阐明，目前关于EMT发病机制的许多学说中，自身免疫性疾病假说得到了越来越多的理论支持[6]。研究发现[7，8]，EMT 患者体内T 细胞和B 细胞活性增强及数量增多，IgG及抗子宫内膜抗体明显增加，免疫监视功能、免疫杀伤细胞的细胞毒作用减弱而不能有效清除异位内膜，所有这些证据都提示在EMT 发生和进展的过程中出现了免疫系统的异常，尤其是CD4+T 淋巴细胞在免疫反应的调控中发挥重要作用。Th17细胞属于CD4+T 淋巴细胞亚型，主要分泌IL-17、IL-6、IL-22、TNF-α 等促炎细胞因子，在机体对抗病原体和防御感染中发挥作用[9]。Treg 细胞属于一种T 细胞亚群，主要通过分泌IL-10、IL-4 和TGF-β 等抗炎细胞因子对效应T 细胞发挥免疫抑制作用，从而避免因为免疫炎症反应导致机体损伤[10]。正常情况下机体处于免疫稳态可由Th17 和Treg 细胞两者相互拮抗，维持动态平衡来实现[11]。维生素D 属于脂溶性维生素，无生物活性，机体可通过皮肤合成维生素D3，在肝内维生素D3被25-羟化酶转化成25（OH）D3，后者在1α-羟化酶作用下生成具有生物活性形式的1，25（OH）2D3[12，13]。血清25（OH）D3因其生物活性稳定易于测定，目前是临床上用作代表体内活性维生素D 水平的最佳检测指标[14]。研究发现[15，16]，维生素D 通过活性形式1，25（OH）2D3与VDR 发生结合反应后，可使T 淋巴细胞的增殖和分化功能受到抑制，从而打破机体免疫稳态，导致Th17/Treg 细胞平衡失调，诱发多种炎症性疾病及自身免疫性疾病。

本研究中，观察组患者外周静脉血25（OH）D3、Treg 细胞及其分泌的细胞因子IL-10、TGF-β 浓度明显低于对照组（P＜0.05），而观察组患者外周静脉血Th17 细胞及其分泌的细胞因子IL-17、IL-6浓度明显高于对照组（P＜0.05），此外，本研究进一步表明，观察组患者25（OH） D3与Th17、IL-17、IL-6 均呈负相关（P＜0.05），与Treg、IL-10、TGF-β均呈正相关（P＜0.05），而对照组患者25（OH）D3与Th17、Treg 细胞及其分泌的细胞因子间无相关性（P＞0.05），本研究结果佐证了相关文献报道[17～20]。由此说明，EMT 患者相较于输卵管因素不孕的非EMT 患者，因为外周血中25（OH）D3缺乏，可促进Th17 细胞和其分泌的相关炎症因子IL-17、IL-6 产生，同时，抑制Treg 细胞和其分泌的相关细胞因子IL-10、TGF-β 产生，从而使Th17/Treg 平衡失调，发生Treg 细胞向Th17 细胞飘移现象，当占优势的Th17 细胞和其分泌的相关炎症因子过度表达后，机体炎症反应增强而免疫抑制作用及有效清除异位内膜能力减弱，出现病理损伤，促进了EMT 发生。

综上所述，维生素D 可能影响EMT 患者Th17/Treg及其相关细胞因子的表达，维生素D 与Th17/Treg 细胞失衡二者间存在负相关，维生素D 可能通过调节EMT 患者外周血Th17/Treg 免疫平衡系统，参与EMT 的发生发展。关于维生素D 和Th17/Treg 细胞在EMT 患者腹腔液、在位及异位内膜中的表达及相关情况，我们后期将进行更深入研究，从而进一步探明EMT 的发病机制，为EMT 预防和靶向治疗提供一定的理论依据和新思路。