基于网络药理学及分子对接探讨旋覆花治疗运动性疲劳的作用机制

张禄璐 梁永林 张李香 芦文娟 安冬

运动性疲劳（Exercise-induced fatigue，EF）是由机体运动本身所引起的，机体生理过程不能持续其功能在特定水平和/或不能维持预定的运动强度，出现运动能力下降的现象[1]。主要表现为动作迟缓、协调能力下降、记忆能力减退、脑力活动迟钝、呼吸急促等[2]。长时间处于EF 状态将造成细胞、组织、脏腑及神经系统损伤，严重危害人体健康。EF 的发生机理复杂，现有的EF 产生假说主要包括：能量耗竭学说、代谢产物堆积学说、自由基学说、内环境稳定性失调学说、疲劳链学说、保护抑制学说等[3，4]。随着体育事业兴起，EF 也随之增加。目前EF 的药物治疗多以辅酶a、牛磺酸等制剂为主，但只能暂时性提升运动能力，长期应用存在副作用、疗效不确切等问题，并且无法从根本上提高机体耐疲劳性。

旋覆花首载于《神农本草经》[5]，别名金沸草，为菊科植物旋覆花的头状花序。其味苦、辛、咸，性微温，归肺、脾、肾、大肠经，具有化痰平喘、降气止呕、疏肝通络、蠲饮利水、补益的功效。现代研究表明，旋覆花主要化学成分包括黄酮类、倍半萜内酯类、萜类、甾醇类、黄铜醇类等，具有抗炎、抗肝损伤、抗氧化等作用[6]。研究证实，旋覆花在一定程度上可以增强体内代谢、促进体质恢复、提高机体耐缺氧及抗疲劳的能力[7]。但旋覆花治疗EF 的具体作用机制目前还没有系统验证与方法学评价。因此本研究利用网络药理学，从分子水平探究旋覆花在治疗EF 中的潜在价值，并且分析有效活性成分及其作用机制，为后期EF 的治疗提供新的依据和作用靶点。

1 材料与方法

1.1 旋覆花有效成分及靶点的筛选借助中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP）[8]检索旋覆花的全部活性成分。以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、药物相似度（Drug-likeness，DL）≥0.18 为指标筛选旋覆花活性成分[9]。同时采用TCMSP 预测活性成分对应的靶蛋白。在UniProt 平台[10]找到与作用靶点相对应的基因名，物种来源选择人类（“Homo sapiens”）。

1.2 EF 疾病相关靶点的获取及整合以“exercise-induced fatigue”为检索词，应用GeneCard、OMIM、DRUGBANK、pharmGKB 等数据库获取EF 疾病靶点[11～14]。合并4 个疾病数据库中收集的疾病靶点，并删除重复靶点。获取疾病靶点与旋覆花作用靶点之间的交集，即旋覆花治疗EF 的潜在治疗靶点，利用R 语言制作韦恩图。

1.3 旋覆花-有效成分-交集靶点调控网络的构建将旋覆花活性成分、旋覆花治疗EF 的潜在治疗靶点导入 Cytoscape 制作“旋覆花-活性成分-潜在治疗靶点”网络。

1.4 靶点蛋白互作（PPI）网络的构建将中药-疾病共有基因输入String[15]，选择“Homo sapiens”，将最小相互作用阈值设为中等“Highest confidence＞0.9”，其余设置为默认值进行PPI 网络构建。使用CytoNCA 插件进行拓扑学分析，使用CytoNCA插件进行拓扑学分析，以度中心性（DC）、介数中心度（BC）、接近中心性（CC）、特征向量中心度（EC）、局部边连通性（LAC）、网络中心性（NC）为节点关键指标，筛选大于六者中位数的成分作为核心靶点基因，结合cytohubba 插件中的degree 算法筛选出排名前三的关键靶基因。

1.5 GO 功能和KEGG 信号通路富集分析使用R语言安装Bioconductor 数据包对药物疾病共有靶点进行GO、KEGG 富集分析，生成条形和气泡图。

1.6 分子对接运用PDB 和PubChem 平台分别获取靶点3D 结构和药物分子结构，使用Autodock vina 软件进行分子对接，使用PyMOL 等软件分析对接强度。

2 结果

2.1 旋覆花有效成分筛选通过TCMSP 数据库检索有旋覆花的成分，并按OB ≥30%和DL ≥0.18 作为筛选旋覆花潜在活性成分的标准，共获得旋覆花活性化合物19 个（见表1）。

表1 旋覆花有效成分

2.2 旋覆花活性成分治疗EF 预测靶点的筛选按1.2 项的研究方法获取并去除重复EF 疾病靶点共计3 643 个（见图1）。运用R 语言获取旋覆花-EF交集靶点制作韦恩图，交集靶点151 个（见图2）。

2.3 “药物-成分-靶点-疾病”网络及关键药物成分该网络有197 个节点，其中药物节点1 个、药物成分节点16 个、靶基因节点180 个，408 条边（见图3）。选择连接度作为参考依据，获取的药物成分连接度排名前三的为槲皮素（131 个）、山柰酚（54 个）、木犀草素（53 个），提示这些成分为旋覆花治疗EF 的关键有效药物成分。

2.4 PPI 网络的构建及关键基因筛选结果将旋覆花-EF 共同靶点导入String 中，进行PPI 网络构建（见图4）。结果导入Cytoscape 软件中，利用Cytoscape 软件中的CytoNCA 插件进行两次筛选，获取核心靶蛋白为NF-κB 转录因子家族（RELA）、细胞周期蛋白D1（CCND1）、CDKN1A、MAPK1、RB1、抑癌基因（TP53）、核因子-κB 抑制因子α（NFKBIA）、转录因子激活蛋白-1（AP-1）家族成员JUN、雌激素受体1（Estrogen receptor 1，ESR1）、MAPK14、HSP90AA1、AKT1、核蛋白转录因子（FOS）、MYC，其中degree 值排名前三的为TP53、HSPgoAAI、Akt1（见图5）。

2.5 旋覆花和EF 重合靶点GO 与KEGG 通路富集分析GO 注释及KEGG 通路富集分析，结果显示共得到GO 富集条目2 421 个，其中细胞生物过程（BP）2 160 个，包括对脂多糖的反应、对药物的反应、抗氧化反应等。细胞组成（CC）64 个，包括膜筏、膜微结构域、质膜筏等。分子功能（MF）197 个，包括脱氧核糖核酸-结合转录因子结合、核受体活动、配体-激活等。选择排名前10 的通路绘制条形图（见图6）。KEGG 预测靶点通路156 个，列举前30条关键信号集通路（见图7）。

2.6 “活性成分-靶点”分子对接选择连接度值排名前三的活性成分：槲皮素、木犀草素、山柰酚和degree 值前3 的潜在核心靶点TP53、HSP90AA1、AKT1 进行分子对接，验证预测结果（见表2）。一般认为结合能越低构象越稳定，小于-7kcal/mol 表明蛋白与配体可紧密结合。结果显示，旋覆花有效成分与TP53、HSP90AA1、AKT1 有强烈的结合活性，验证了本研究数据的可靠性，运用AutoDock 将对接结果进行可视化，绘制3D 示意图（见图8）。

表2 旋覆花活性成分与靶点结合能

3 讨论

根据EF 的临床表现，中医将其归于“劳倦”、“劳损”、“虚劳”的范畴，其病因病机在医学古籍中已有详细记载[16]。《素问·调经论》[17]言明：“所有劳倦，形气衰少”；《中藏经·劳伤论》[18]：“劳者，劳于神气也；伤者，伤于形容也”；《丹溪心法·耳聋》[19]：“劳役伤于血气”；《仁斋直指》[20]：“终日役役，神倦力疲”。由此可见，脏腑耗损、气血耗伤为EF 发生的主要原因，故临床治疗多以补益法为主。旋覆花在《神农本草经》中记载具有补中的功效，且《开宝本草》[21]言明其可“通血脉，益色泽”。李然等[22]通过对古代本草、古代方剂考察探究旋覆花的潜在功能时发现，在《普济方》中含有旋覆花治疗虚损症候的方剂达22 首，因此推测旋覆花具有补益的功用。

本研究通过中药数据库信息的挖掘，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图，获得旋覆花16 个活性成分。根据OB 值排序，排前三的活性成分为槲皮素、木犀草素、山柰酚，推测这三种成分为旋覆花治疗EF 的主要成分，而其他成分予以辅助。槲皮素是六类黄酮化合物中的一类，具有抗炎、镇痛、抗氧化、神经保护等多种生物学特性[23]。5-羟色胺（5-HT）是一种主要存在于中枢神经系统的抑制性神经递质，力竭运动后5-HT/多巴胺比值的升高促进了中枢疲劳的发生[24]。研究表明，槲皮素可恢复星形胶质细胞和小胶质细胞，降低脑中5-HT 的表达，延缓或消除运动性中枢疲劳[25]。研究表明，木犀草素通过增加大鼠原代肝细胞的HO-1 和谷氨酸半胱氨酸连接酶，减少乳酸、血尿素氮等代谢产物的产生，改善肌肉机构和肝糖原的合成、储备，从而降低疲劳感[26]。此外，木犀草素能抑制力竭运动后肝及骨骼肌中白细胞介素-6（IL-6）和IL-1β等促炎因子的表达，预防慢性疲劳的产生[27]。多酚类为天然抗疲劳活性成分，然而山柰酚治疗EF的作用机制缺乏文献支持还需进一步实验证明。

筛选出的核心靶点中，TP53、HSP90AA1、Akt1的degree 值排名靠前，预测为治疗EF 的关键节点蛋白。TP53 在促线粒体生物发生、节能量代谢、平衡氧化应激等过程中起重要作用[28]。TP53 的缺失使能量产生方式由有氧呼吸转向无氧糖酵解，线粒体呼吸强度降低影响能量的产生，因而使机体耐疲劳性下降[29]。HSP90AA1 类属热休克蛋白家族，参与多种生物过程，对自由基破坏的生物膜机构起到重要的保护作用[30]。Akt1 在多种组织中广泛表达，激活后可参与细胞凋亡、葡萄糖代谢、蛋白质合成等多种细胞过程。研究表明，Akt1 可通过活化PGC1-a 促进线粒体生物合成，为细胞组织提供能量[31]。

GO 富集分析显示旋覆花治疗EF 涉及抗氧化反应、对金属离子响应、活性氧的代谢过程、膜微结构域等生物过程。KEGG 通路富集分析显示，旋覆花治疗EF 具有多条通路，主要为PI3K-Akt 信号通路、TNF 信号通路、细胞凋亡信号通路、TP53 信号通路等。研究表明，EF 的产生与自由基堆积、炎症反应及线粒体功能障碍等有关[32]。PI3K-Akt 信号通路是人体抗氧化过程的重要途径，目前已有大量细胞体外实验证实，抗氧化药物可以通过激活PI3K-Akt 信号通路提高SOD、GSH-Px 等抗氧化酶的活性，从而降低自由基含量，有效防治细胞DNA氧化损伤、线粒体功能障碍等作用[33]。TNF 是肿瘤坏死因子，具有促炎症、诱发凋亡等生物学效应。长时间耐力运动促使血清及骨骼肌中TNF-α 活性升高，过多的炎性细胞因子将引起组织损伤，进一步加速疲劳[32]。

综上所述，本研究通过网络药理学方法及分子对接初步验证，旋覆花具有多成分、多靶点、多通路治疗EF 的特点，可通过抗炎、抗氧化应激、抑制细胞凋亡、保护线粒体的等生物学过程共同发挥抗疲劳作用。这将为预防和治疗EF 提供数据支撑及参考依据。然而网络药理学和分子对接技术局限于现有的数据和软件，这使得预测结果不能展示其全面的药理作用，并且中药成分在煎煮过程中发生的复杂反应，这使药物在体内的作用机制与预测结果存在差异。故想要进一步研究旋覆花治疗EF 的作用机制还需要对关键靶点及通路进行实验验证。