lncRNA UCA1通过miR-513a-3p/CYP1B1生物学轴促进人肺癌细胞增殖和迁移的机制研究

徐绍娜 徐晓焱 祝慧慧 马山 张淑芹 周晶琳

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。在我国，每年约有81 万例新发肺癌患者，占全世界年度新发肺癌病例数的1/3[1]。据报道，早期肺癌患者5年生存率可达90%，而进展期肺癌患者5年生存率仅为17.6%[2]。由此可见，对于肺癌患者尽早诊断、尽早治疗是其生存的关键。虽然随着影像学技术的不断发展完善，我国早期肺癌诊断率不断提高，但是目前我国早期肺癌诊断率也仅为10%，多数肺癌患者初次诊断时已处于晚期[3]。因此，研究肺癌发展的分子机制对提高肺癌患者生存率意义重大。

长链非编码RNA（Long-chain non-coding RNA，lncRNA）是长度超过200 个核苷酸的单链非编码RNA，最初被认为是“垃圾”RNA。但近年来研究发现，lncRNA 在肿瘤细胞活动中发挥重要作用，如肿瘤细胞化学抗性、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等[4，5]。尿道癌相关基因1（Urothelial cancer associated 1，UCA1）是一种在多种恶性肿瘤中被发现异常表达的lncRNA，并被发现促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移以及化疗抵抗性[6～8]。早期的一项研究发现，UCA1 在胃癌多药耐药性细胞中表达升高，而敲低UCA1 则可以逆转胃癌细胞多药耐药性[8]。然而，UCA1 表达对肺癌细胞增殖和迁移的影响，以及其作用的分子机制仍未明确。细胞色素P450 家族1 亚家族B 成员1（Cytochrome P450 family 1 subfamily B member 1，CYP1B1）是细胞色素P450 超基因家族的成员，并且参与多种重要转录因子的调节，其可以通过氧化和代谢多种前致癌物和抗癌药物帮助癌细胞降低化学药物的毒性，如活化多环芳烃、杂环胺、芳族胺、硝酸盐和介导17-雌二醇的C4-羟基化[9，10]。此外，CYP1B1 代谢物4-羟基化的雌激素可显著增加8-羟基鸟嘌呤的水平，引起DNA 单链断裂，具有DNA 损伤作用，并具有潜在的致癌性[9]。有研究认为CYP1B1在肿瘤组织有特异性表达，可能在肺癌的形成中起着重要作用[11]。MicroRNA（miRNA）是一种内源性的小RNA 分子，在基因转录后能调节基因的表达。许多miRNA 被证实与包括肺癌的多种肿瘤相关，如过表达miR-513a-3p 后，人肺腺癌细胞A549/C DDP 和SPC-A-1 中GSTP1 蛋白表达明显下调，miR-513a-3p 可以在转录后水平靶向调控GSTP1基因的表达[12]。本研究探讨lncRNA UCA1 通过microRNA-513a-3p（miR-513a-3p）和CYP1B1 分子轴对肺癌细胞增殖和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 研究方法对比人正常肺上皮细胞（BEAS-2B）与不同肺癌细胞（A549、H1299、NCI-H3255、NCI-H460、NCI-H838）中UCA1 表达以及细胞增殖、迁移能力。生物信息学分析UCA1、miR-513a-3p、CYP1B1 相互结合的基因序列。敲低肺癌细胞UCA1表达，上调肺癌细胞miR-513a-3p 表达，下调肺癌细胞miR-513a-3p 表达。双荧光素酶基因报告实验分析其在肺癌细胞中表达的相互影响。共同向肺癌细胞A549 中转入si-UCA1 和miR-513a-3p 抑制剂（inhibitor），对比其与si-UCA1 肺癌细胞中CYP1B1表达及细胞增殖、迁移能力。

1.2 细胞培养和细胞转染人正常肺上皮细胞（BEAS-2B）和肺癌细胞（A549、H1299、NCI-H3255、NCI-H460 和NCI-H838）均购自美国典型培养物保藏中心。所有细胞均被培养于添加10%胎牛血清（Gbico，美国）的DMEM 培养基（Invitrogen，美国），培养条件为37℃和5%CO2。miRNA 转染阴性对照（NC）、miR-513a-3p 模拟物（mimic）、miR-513a-3p抑制剂（inhibitor）、小干扰RNA 转染阴性对照（si-NC）和UCA1 小干扰RNA（si-UCA1）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1，并根据LipofectamineTM2000 转染试剂（Thermofiher，美国）说明书被直接转入肺癌细胞A549，转染72h 进行后续研究。

表1 PCR 引物、miRNA 及小干扰RNA 序列

1.3 定量PCR向细胞中加入RNAiso plus（TAKARA，日本）以提取总RNA，然后按照反转录试剂盒（TAKARA，日本）说明书配置反转录体系以制备cDNA。根据GoTaq® qPCR Master Mix 试剂盒（Promega，中国）说明书配置20μl 定量PCR 反应体系，通过定量PCR 仪扩增目的基因。以β-actin 为内参，用2-△△CT法计算目的基因的相对表达量。

1.4 CCK8 检测细胞增殖活性在96 孔板中接种104个细胞，培养72h 后去除培养基，加无菌PBS 洗涤3 遍后加入10μl CCK8 试剂（碧云天生物科技公司，中国）和100μl DMEM 细胞培养液混合物，37℃和5%CO2条件下培养2h，酶标仪测定OD490。

1.5 Transwell 小室检测细胞迁移能力8μm 孔径的24 孔Transwell 小室用于评估细胞迁移能力，Transwell 上室接种0.5×105个细胞/100μl 培养基，Transwell 下室加入600μl 含有2.5%胎牛血清的DMEM 培养基。37℃和5%CO2条件下培养24h 后，去除Transwell 下室细胞培养基，无菌PBS 清洗两遍后，加入甲醛室温固定30min 后再加入0.1%结晶紫室温染色20min，PBS 清洗3 遍后，在显微镜下观察细胞，每孔观察3 个视野，计数。

1.6 双荧光素酶基因报告实验向肺癌细胞（A549）中转入小干扰RNA（si-UCA1）敲低肺癌细胞UCA1 表达（si-NC 作为阴性对照），转入miR-513a-3p 模拟物（mimic）上调肺癌细胞miR-513a-3p 表达（NC 作为阴性对照），转入miR-513a-3p 抑制剂（inhibitor）下调肺癌细胞miR-513a-3p 表达。双荧光素酶基因报告实验分析其在肺癌细胞中表达的相互影响。构建肺癌细胞双荧光素酶报告基因载体，合成待检测的基因与对照组，然后进行细胞转染（同1.2），按照检验实验操作步骤检测试剂盒，试验过程严格按照试剂盒说明书进行，预测实验结果。

1.7 生物信息学分析方法采用公共数据库中肺癌组织的高通量测序数据或微阵列基因芯片数据，分析UCA1 与miR-513a-3p 相互结合的基因序列，使用targetscan 数据库（http://www.targetscan.org/vert_71/）对miR-513a-3p 靶向结合的基因进行预测。

1.8 统计学分析采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两组间比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UCA1 在肺癌细胞中的表达及与增殖、迁移的关系与人正常肺上皮细胞（BEAS-2B）相比，UCA1 在不同肺癌细胞（A549、H1299、NCI-H3255、NCI-H460 和NCI-H838）中表达均升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1A。此外，与BEAS-2B相比，CCK8 检测显示肺癌细胞的细胞增殖活性显著升高，迁移到Transwell 下室的肺癌细胞数目显著增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）；此外，在不同肺癌细胞中，细胞的增殖和迁移能力随UCA1 表达升高而升高，见图1B、1C。

2.2 UCA1 靶向抑制肺癌细胞中miR-513a-3p 的表达生物信息学分析显示，UCA1 与miR-513a-3p 具有相互结合的基因序列（见图2A）。双荧光素酶基因报告实验显示：与NC 相比，miR-513a-3p-mimic 可以显著抑制转入野生型UCA1 序列（WT-UCA1）组荧光素酶活性（P＜0.05），而不影响转入突变型UCA1 序列（MUT-UCA1）组荧光素酶活性（P＞0.05）；同样，与NC 相比，miR-513a-3pinhibitor 可以显著升高转入WT-UCA1 组荧光素酶活性（P＜0.05），而不影响转入MUT-UCA1 组荧光素酶活性（P＞0.05），见图2B。

通过转入针对UCA1 的小干扰RNA（si-UCA1）以敲低UCA1 在肺癌细胞A549 中的表达，结果显示：与转入无意义序列的小干扰RNA 阴性对照组（si-NC）相比，si-UCA1 显著降低肺癌细胞中UCA1的表达（P＜0.05），显著提高肺癌细胞中miR-513a-3p 的表达（P＜0.05），见图3。

2.3 miR-513a-3p 对肺癌细胞中CYP1B1 表达的影响通过targetscan 数据库（http：//www.targetscan.org/vert_71/）对miR-513a-3p 靶向结合的基因进行预测发现，CYP1B1 与miR-513a-3p 具有相互结合的基因序列（见图4A）。双荧光素酶基因报告实验显示：与转入无意义基因序列组（NC）相比，miR-513a-3p 模拟物（mimic）可以显著抑制转入野生型CYP1B1 序列（WT-CYP1B1）组荧光素酶活性（P＜0.05），而不影响转入突变型CYP1B1 序列（MUT-CYP1B1）组荧光素酶活性（P＞0.05）；同样，与NC 相比，miR-513a-3p 抑制剂（inhibitor）可以显著升高转入WT-CYP1B1 组荧光素酶活性（P＜0.05），而不影响转入MUT-CYP1B1 组荧光素酶活性（P＞0.05），见图4B。此外，与NC 组相比，mimic 显著降低肺癌细胞A549 中CYP1B1 的表达（P＜0.05），而inhibitor 显著升高肺癌细胞A549 中CYP1B1 的表达（P＜0.05），见图4C。

2.4 UCA1/miR-513a-3p/CYP1B1 轴调节肺癌细胞的增殖和迁移与si-UCA1 组相比，共同向肺癌细胞A549 中转入si-UCA1 和miR-513a-3p 抑制剂（inhibitor）可以显著提高因转入si-UCA1 而降低的CYP1B1 表达、肿瘤细胞活性及迁移数目，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

3 讨论

世界卫生组织国际癌症研究机构发布的2020年全球最新癌症负担数据显示[13]，肺癌是世界第五大常见恶性肿瘤。在世界范围内，每年新发肺癌患者高达100 万，因肺癌死亡的人数超过70 万。在中国，肺癌发病率居所有恶性肿瘤的首位，每年约有81 万例肺癌新病例[14]。由于缺乏有效的早期诊断技术，大多数肺癌患者被诊断时已为晚期[15]。因此，研究肺癌发生发展的分子机制对于提高肺癌患者生存率、延长患者生存时间意义重大。本研究显示，UCA1 在肺癌细胞中表达高于人正常肺黏膜上皮细胞，并且在不同类型肺癌细胞中，UCA1 表达越高，肺癌细胞增殖和迁移能力越强。已有研究发现，UCA1 在膀胱癌[6]、乳腺癌[16]以及其他多种恶性肿瘤中表达增高，并且其高表达可促进恶性肿瘤的增殖和迁移，表明UCA1 在恶性肿瘤细胞中发挥癌基因功能。此外，UCA1 被发现在胃癌多药耐药性细胞中表达升高，而敲低UCA1 则可以逆转胃癌细胞多药耐药性[8]。结合本研究结果，提示UCA1 在肺癌细胞中发挥癌基因功能，并与促进肺癌细胞增殖和迁移有关。

作为一个非编码RNA，UCA1 并不能直接编码蛋白质，其主要通过两种方式参与细胞生命活动的调控[17，18]：直接调控编码蛋白的基因转录；通过与编码蛋白基因竞争micRNA 结合位点而间接调控蛋白质的表达。本研究发现，UCA1 及CYP1B1 存在与miR-513a-3p 相同的结合序列，并且经双荧光素酶基因报告实验证实，miR-513a-3p 与UCA1和CYP1B1 均靶向结合。此外，本研究还发现，敲低UCA1 或上调miR-513a-3p 可下调肺癌细胞中CYP1B1 表达，抑制miR-513a-3p 可上调CYP1B1表达，而同时敲低UCA1 和下调miR-513a-3p 则可上调因敲低UCA1 下调的CYP1B1 表达，提示UCA1 通过与CYP1B1 竞争性结合miR-513a-3p 而正向调控CYP1B1 表达。与si-UCA1 组相比，共转入si-UCA1 和inhibitor 可以显著提高因转入si-UCA1 而降低的CYP1B1 表达和肺癌细胞的增殖、迁移能力，表明UCA1 通过间接促进CYP1B1 表达而促进肺癌细胞的增殖和迁移。UCA1 的这种基因调控方式在之前的研究中也被发现，如陆小琴等[19]研究显示，UCA1 通过靶向调控miR-613 而促进乳腺癌细胞的增殖和转移。

综上所述，UCA1 在肺癌细胞中表达升高，并且其高表达通过与CYP1B1 竞争性结合miR-513a-3p而间接促进CYP1B1 的表达，最终促进肺癌细胞在体外增殖和迁移。但本研究存在不足：由于缺乏肺癌组织样本，未能验证UCA1 在肺癌组织中的表达，及其与miR-513a-3p 和CYP1B1 表达的关系；本研究仅使用细胞系在体外研究UCA1 的功能，缺乏体内研究数据。