基于多指标评价的金蕾颗粒质量标准研究

王嘉鸣，曲馨，薄双琴，景明

(甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000)

金蕾复方是甘肃中医药大学刘喜平主任医师的临床经验方，以“石淋要药”之称的金钱草(LysimachiaeHerba)、藏药湿生扁蕾(GentianopsispaludosaMa)等配伍而成，临床主要用于治疗肝胆湿热所致的胁痛、口苦，胆囊炎、胆管炎等[1]。君药湿生扁蕾又名机合斗，味苦，性寒，为龙胆科扁蕾属植物湿生扁蕾[Gentianopsispaludosa(Hook.f.) Ma]的干燥全草[2]，具有消热解毒、利胆止泻、祛湿退黄的功效，现临床主要用于高血压、急性肾盂肾炎、结膜炎的治疗，藏医常用于治疗流行性感冒及胆病引发的发热[2-5]。臣药金钱草味甘、咸，性微寒，为报春花科植物过路黄(LysimachiachristinaeHance)的干燥全草，具有清热解毒、利尿通淋、利湿消黄的功效，临床常用于治疗石淋、热淋、小便涩痛、湿热黄疸、胆胁胀痛，外用可治疗痈肿疔疮和虫蛇咬伤[6-7]。诸药配伍共煎，实为临床治疗胆囊炎的良方。为解决原经验方汤剂的煎煮、储存与携带方面的问题，并保留原汤剂吸收快与显效迅速的优点，本研究选择颗粒剂这种剂型。

本研究依据《中国药典》2020年版颗粒剂项下相关规定对金蕾颗粒性状、溶化性、水分、粒度进行评价，采用薄层色谱(TLC)法定性鉴别制剂中湿生扁蕾、金钱草，采用高效液相色谱(HPLC)法测定制剂中当药黄素、木犀草素、山柰酚的含量，为金蕾颗粒质量标准的建立提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)；XPE105型分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；HGZF-9203型电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)； ZF-1三用紫外分析仪(杭州齐威仪器有限公司)；SB5200D超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；GB6003-85药典检验筛(浙江上虞市华丰五金仪器有限公司)。

1.2 试药 金蕾颗粒(甘肃中医药大学，批号分别为20211006、20211007、20211008、20211009、20211010、20211011、20211012、20211013、20211014、20211015)；当药黄素(批号：B20281，HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司)；木犀草素(批号：B20888，HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司)；山柰酚(批号：B21126，HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司)；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 性状 取金蕾颗粒10批，分别置于白纸上，观察颜色，嗅闻气味，加热水溶解，尝其味道，10批金蕾颗粒均为颗粒状，颜色呈棕褐色，气香，味苦。

2.2 薄层色谱鉴别

2.2.1 湿生扁蕾的鉴别[8]取3批金蕾颗粒各3 g，分别加80%甲醇100 mL，回流1 h，滤过，滤液蒸干，甲醇复溶，作为供试品溶液。同法制备对照药材溶液和不含湿生扁蕾的阴性对照溶液。取木犀草素对照品，加甲醇制成每1 mL含0.4 mg的溶液，作为对照品溶液。

按《中国药典》2020年版(四部)通则0502，吸取上述6种溶液，分别点于同一硅胶G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶6∶1∶0.7，V/V/V/V)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%AlCl3-乙醇溶液显色，于紫外光(365 nm)下检视，结果显示，在图1中A、B、C色谱在与F、D色谱相应的位置处显示有相同颜色的荧光斑点，阴性对照在该位置处无荧光斑点，说明样品中均含有木犀草素且阴性无干扰，详见图1。

A、B、C.3批颗粒供试品;D.湿生扁蕾对照药材;E.湿生扁蕾阴性对照;F.木犀草素图1 湿生扁蕾的薄层色谱图

2.2.2 金钱草的TLC鉴别[8-9]取3批金蕾颗粒各3 g，分别加入80%的甲醇溶液100 mL，回流1 h，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加水10 mL溶解，加稀盐酸10 mL，水浴加热1 h，取出，迅速冷却，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，用水30 mL洗涤，弃去水液，乙酸乙酯蒸干，加甲醇复溶，作为供试品溶液。同法制备对照药材溶液和不含金钱草的阴性对照溶液。取山柰酚对照品，加甲醇制成每1 mL含0.4 mg的溶液，作为对照品溶液。

按《中国药典》2020年版(四部)通则0502，吸取上述6种溶液，分别点于同一硅胶G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶4∶1,V/V/V)作为展开剂，展开，晾干后以甲苯-甲酸甲酯-甲酸(9∶9∶2,V/V/V)再次展开，晾干，喷以3%AlCl3-乙醇溶液显色，105 ℃加热，于紫外光(365 nm)下检视，结果显示，在图2中A、B、C色谱在与E、D色谱相应的位置处显示有相同颜色的荧光斑点，阴性对照在该位置处无荧光斑点，说明样品中均含有山柰酚且阴性无干扰，详见图2。

A、B、C.3批颗粒供试品;D.金钱草对照药材;E.山柰酚;F.金钱草阴性对照图2 金钱草的薄层色谱图

2.3 检查

2.3.1 水分 取金蕾颗粒(批号：20211006、20211008、20211010)约3 g，精密称定，平铺于恒重的扁平称量瓶中，参照《中国药典》2020年版(四部)通则0832水分测定法第二法(烘干法)测定，重复测定3次，结果见表1。结果显示，3批颗粒的水分均小于8.0%，符合药典规定。

表1 金蕾颗粒3批样品水分检查结果(%)

2.3.2 粒度 分别取10批(批号：20211006、20211007、20211008、20211009、20211010、20211011、20211012、20211013、20211014、20211015)金蕾颗粒各20 g，称定重量，参照《中国药典》2020年版(四部)通则0982双筛分法测定，结果显示10批颗粒的粒度分别为3.21%、4.79%、4.73%、3.88%、4.01%、5.22%、4.17%、3.92%，不能通过一号筛和通过五号筛颗粒占总颗粒比例均不超过15%，即金蕾颗粒粒度符合《中国药典》颗粒剂项下规定。

2.4 含量测定

2.4.1 色谱条件[10]色谱柱：Agilent SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)，流动相为0.10%磷酸水溶液(A)-甲醇(B)，0～10 min为A∶B=70∶30～60∶40线性洗脱，10～17 min为A∶B=60∶40～50∶50线性梯度洗脱，17～40 min为A∶B=50∶50～30∶70线性梯度洗脱，40～50 min为A∶B=30∶70等度洗脱；流速1.0 mL·min-1，检测波长360 nm，柱温30 ℃，进样量5 μL。

A.对照品；B.供试品；C.金钱草阴性对照；D.湿生扁蕾阴性对照 1.当药黄素；2.木犀草素；3.山柰酚图3 金蕾颗粒样品及阴性对照品HPLC图

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称定当药黄素、木犀草素、山柰酚对照品适量，甲醇溶解定容，得到质量浓度分别为0.10、0.21、0.03 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备 取本品颗粒剂(批号：20211006)2 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇超声(频率40 kHz，功率900 W，40 min)溶解，放冷，加甲醇补足重量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4.4 阴性样品溶液的制备 按处方中各味药的比例，分别称取不含湿生扁蕾、金钱草的其他药材，按照优选的金蕾颗粒剂的制备工艺制成颗粒制剂，再按“2.4.3”项下方法制备，即得。

2.4.5 专属性试验 精密吸取上述混合对照品溶液、湿生扁蕾阴性对照溶液、金钱草阴性对照溶液、供试品溶液各5 μL，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图(见图3)。结果阴性样品无干扰，方法专属性良好。

2.4.6 线性关系考察 分别配制系列浓度对照品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，以对照品进样质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到各成分的回归方程、相关系数及线性范围，得当药黄素的线性方程：Y=12.266X-77.246，r=0.999 8，线性范围：20.0～240.0 μg·mL-1；木犀草素的线性方程：Y=13.633X+79.111，r=0.999 9，线性范围：24.0～288.0 μg·mL-1；山柰酚的线性方程：Y=13.48X+46.429，r=0.999 9，线性范围：0.4～10.0 μg·mL-1，当药黄素、木犀草素、山柰酚在该色谱条件下线性关系良好。

2.4.7 精密度试验 精密吸取混合对照品按“2.4.1”项下色谱条件进样测定6次，记录当药黄素、木犀草素、山柰酚的峰面积，并计算相应的RSD值，当药黄素、木犀草素、山柰酚峰面积的RSD分别为0.83%、0.67%、0.98%，表明该液相色谱仪精密度良好。

2.4.8 稳定性试验 分别于0、4、6、8、12、24 h精密吸取混合对照品5 μL，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，结果当药黄素、木犀草素、山柰酚在24 h内所测峰面积的RSD分别为0.97%、1.69%、0.88%(n=6)，表明供试品溶液中当药黄素、木犀草素、山柰酚3个指标成分室温条件放置24 h内稳定。

2.4.9 重复性试验 取同一批金蕾颗粒2 g，精密称定，按照“2.4.3”供试品溶液制备方法平行制备6份，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录当药黄素、木犀草素、山柰酚的峰面积，并计算每克颗粒中指标成分的含量，结果当药黄素、木犀草素在金蕾颗粒中的平均含量为0.995 5、0.677 0、0.011 9 mg·g-1，RSD分别为2.27%、2.58%、3.32%(n=6)，表明重复性均良好。

2.4.10 加样回收率试验 取已知指标成分含量的本品颗粒6份，每份约1 g，精密称定，置于25 mL容量瓶中，各加入含一定量当药黄素、木犀草素、山柰酚，照“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，结果当药黄素、木犀草素、山柰酚的平均加样回收率分别为99.23%、99.42%、99.49%(n=6)，RSD分别为1.88%、1.32%、2.84%(n=6)，表明该方法加样回收率符合要求，具有较好的准确性。

2.4.11 样品测定 取10个批次的金蕾颗粒(批号：20211006、20211007、20211008、20211009、20211010、20211011、20211012、20211013、20211014、20211015)样品，每批约2 g，精密称定，照“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，结果见表2。结果显示金蕾颗粒中当药黄素、木犀草素、山柰酚平均含量分别为0.984 0、0.645 7、0.011 4 mg·g-1。

表2 金蕾颗粒中指标成分的含量(n=10)

3 讨论与结论

3.1 剂型的选择与剂型通则的研究 金蕾颗粒是在甘肃中医药大学刘喜平主任医师的临床经验方的研究基础上，针对药物的运输储存需求研究与患者的使用研究选择颗粒剂这一剂型。本研究参照《中国药典》2020年版制剂通则0104中颗粒剂的有关规定，对金蕾颗粒的性状、水分、溶化性、粒度等进行检查，结果均符合药典规定。

3.2 薄层色谱方法的选择 金蕾复方的君药为湿生扁蕾，臣药为金钱草，故本研究将该两味药纳入金蕾颗粒质量标准研究。湿生扁蕾作为藏药在《中国药典》中并未收录，本文所引用的湿生扁蕾薄层色谱鉴别方法为前期课题组试验摸索结果，所得薄层鉴别方法阴性无干扰，专属性好；在金钱草的薄层鉴别中，根据《中国药典》2020年版(一部)“金钱草”项下鉴别方法结合高效液相色谱法测定结果，阴性对照药材相应位置出现荧光斑点，得出为假阴性现象，通过前期实验以及查阅文献，最终决定采用两次展开的方法对金钱草进行薄层鉴别，所得薄层鉴别方法无阴性干扰，专属型好。

3.3 含量测定指标的选择 本方的主要用途为胆囊炎的治疗。研究表明，本方中的君药湿生扁蕾中的黄酮类成分有抗菌、抗氧化的作用，故选择湿生扁蕾中黄酮类代表成分当药黄素、木犀草素作为指标成分；而臣药金钱草中的黄酮类能够有效抑制并促进结石的排出，结合《中国药典》2020年版中金钱草的含量测定指标以及初期试验结果，选择其中的山柰酚为指标成分[11-13]。故金蕾颗

粒的有效成分指标测定的选择为当药黄素、木犀草素、山柰酚。

3.4 色谱条件的选择 在含量测定过程中，以甲醇作为提取溶剂，超声提取40 min，用0.1%磷酸水-甲醇为流动相进行梯度洗脱，该测定方法稳定、可行。

3.5 结论 对金蕾颗粒的质量标准进行了初步研究，采用薄层色谱法确定了湿生扁蕾和金钱草的定性鉴别方法；建立了高效液相色谱法测定金蕾颗粒中当药黄素、木犀草素、山柰酚的含量测定方法；初步拟定金蕾颗粒质量标准草案。本研究为金蕾颗粒制定了稳定、可靠的质量标准，为其质量标准研究提供了一定的参考价值。但本研究仅对金蕾颗粒做了较基础的质量标准研究，颗粒剂微生物检查、加速试验还有待于检查。