新型阿卡斑病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR建立及广西边境地区蚊携带新型阿卡斑病毒调查

马 玲，孟 菲，陆晨阳，陈赫威，蔡 畅，秦树英，覃绍敏，刘金凤，陈凤莲，吴健敏

（广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001）

0 引言

【研究意义】阿卡斑病毒（Akabane vrius，AKAV）是一种以吸血昆虫为传播媒介的虫媒病毒，主要感染牛和羊等动物，造成母畜流产、早产、死胎及胎儿畸形，且可通过垂直传播侵害胎儿中枢神经，导致积水性无脑综合症和新生胎儿关节弯曲（谢佳芮等，2019）。AKAV引起的赤羽病目前主要流行于热带、亚热带及温带地区，在我国广泛流行；除牛、羊外，AKAV还可感染马、水牛和骆驼，曾在猪、兔、牦牛、河马、长颈鹿、大象，甚至灵长类动物中检出AKAV抗体，严重威胁着草食动物养殖业健康发展及野生动物安全，已被世界动物卫生组织（OIE）列为法定报告动物疫病和国际动物贸易的重点检疫对象，也是我国进口牛、羊必检的疫病之一（Murakami et al.，2017；原恺，2019）。2016年，本课题组在广西竹鼠中分离获得新型AKAV，首次证实AKAV可感染啮齿动物（Tang et al.，2017）；与传统毒株相比，新型AKAV毒力增强、临床症状有明显变化，说明在宿主范围和致病性上已发生改变。随后，云南、广东、四川、湖南、海南等周边省份相继在牛、蠓虫、三带喙库蚊、中华按蚊及致倦库蚊等物种中发现与新型AKAV高度同源的毒株，推测新型AKAV已在一定范围内流行（宋颂，2018；范娜，2019；孟锦昕等，2019；吴德等，2019；Cao et al.，2019）。因此，亟待建立更灵敏、更准确的检测方法，加强对新型AKAV的监控及科学评估其传播的潜在风险。【前人研究进展】AKAV隶属于布尼亚病毒目（Bunyavirales）周布尼亚病毒科（Peribunyaviridae）正布尼亚病毒属（），为分节段单股负链RNA病毒，基因组全长12 kb，由S、M、L共3个基因节段构成（Wang et al，2017，2019；Chen et al.，2021）。S基因编码核衣壳蛋白（N）和非结构蛋白（NSs），高度保守。其中，N蛋白存在3个抗原表位，具有群特异性，可刺激机体产生抗体；而NSs蛋白可干扰细胞蛋白合成并诱导细胞凋亡。M基因高度变异，编码病毒囊膜糖蛋白（Gn和Gc），具有型特异性，分别诱导产生中和抗体和血凝抑制抗体（Wernike et al，2017；Yanase et al，2017）。Tang等（2017）通过分析新型AKAV基因序列，发现该毒株S基因具有我国牛源AKAV毒株的遗传特征，而M基因与日本、韩国强致病性AKAV毒株的同源性更高。目前，普遍认为AKAV只存在1个血清型，但通过S基因和M基因进化分析可将全球的AKAV毒株分为4个基因型（亚洲型、澳洲型、其他型和第四型），其中基因I型（亚洲型）又可分为Ia和Ib亚型，包括新型AKAV在内的我国分离毒株多属于Ia亚型（Kobayashi et al.，2007）。因此，很多研究以S基因、M基因作为AKAV核酸检测靶基因，如RT-PCR（唐海波等，2018）、套式RT-PCR、荧光定量RT-PCR（Golender etal.，2018；孟锦昕等，2020）、环介导等温扩增（张吉红等，2013），以及针对新型AKAV的RT-PCR检测方法（唐海波等，2018）。RT-PCR操作简便，但敏感性略低；环介导等温扩增等方法具有独特的扩增模式，但引物设计较复杂；而荧光定量RT-PCR具有操作简便、特异、敏感、准确性高、高通量等优势，已广泛应用于病原微生物检测。【本研究切入点】由于蚊虫中病毒载量较低，传统的PCR难以检出，因此亟需更灵敏、更准确的检测方法以开展新型AKAV监测，为有效防控新型AKAV提供科学依据，但目前尚无针对新型AKAV的荧光定量RT-PCR检测方法，也鲜见我国边境地区新型AKAV流行情况的研究报道。【拟解决的关键问题】分别针对新型AKAV的S基因和M基因主要变异位点设计引物，建立灵敏、准确的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法，并结合序列测定开展广西边境地区蚊携带新型AKAV调查，旨在了解其流行趋势及遗传进化特征，为建立重要蚊媒病毒病预警机制提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

核酸抽提试剂盒MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 9767、PrimeScriptRT Master Mix（RR036Q）、Premix（RR003Q）、pMD18-T 载体（6011）和SYBR Premix ExII（RR820A）购自宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（DP209）及质粒抽提试剂盒（CW0500A）购自天根生物科技（北京）有限公司；病毒RNA提取试剂盒（CW0586）购自北京康为世纪生物科技有限公司；DMEM（12800-017）和胎牛血清（10099-141）购自赛默飞世尔公司；Vero细胞、竹鼠圆环病毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、布鲁氏杆菌由广西兽医生物技术重点实验室保存提供；其他化学试剂均为国产分析纯。荧光定量PCR仪（Accurate 96型）购自大龙兴创实验仪器（北京）股份公司。

1.2 引物设计与合成

根据GenBank已公布新型AKAV毒株GXLCH16-70的S基因（KY381274）和M基因（KY381280）序列设计特异性引物（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 SYBR Green I荧光定量RT-PCR建立

1.3.1 标准品制备 以感染新型AKAV的Vero细胞基因组提取物为模板，采用引物AKAVSF/SAKAVSR、AKAVMF/AKAVMR分别扩增S基因和M基因片段，然后按经典分子克隆方法连接至pMD18-T载体上。抽提阳性克隆质粒pMD-AKAVS和pMDAKAVM，利用分光光度计测定质粒浓度并计算其拷贝数，分别制备1.0×10copies/μL标准品，经10倍梯度稀释后作为SYBR Green I荧光定量RT-PCR标准品（马玲等，2017）。

1.3.2 SYBR Green I荧光定量RT-PCR反应条件优化 在不同引物浓度（2、4、5、6和10 μmol/L）、退火温度（58、60、62、64、66和68 ℃）、Mg浓度（0、0.5和1.0 μmol/L）、两步法或三步法等条件下进行SYBR Green I荧光定量RT-PCR扩增，通过值、标准曲线斜率、相关系数、扩增效率及扩增准确性等指标确定最佳反应条件。

1.3.3 标准曲线建立及结果判定 在10～10copies/μL的浓度范围内，以10倍梯度稀释的标准品pMDAKAVS和pMD-AKAVM为模板进行SYBR Green I荧光定量RT-PCR扩增，并绘制熔解曲线和标准曲线。

1.4 SYBR Green I荧光定量RT-PCR评价

1.4.1 特异性试验 应用针对新型AKAV建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、竹鼠圆环病毒和布鲁氏杆菌，测定各样品值；同时检测转染新型AKAV的Vero细胞，每个样品设3个重复。

1.4.2 灵敏性和检测范围 分别以浓度为1.0×10～1.0×10copies/μL的标准品pMD-AKAVS、1.0×10～1.0×10copies/μL的标准品pMD-AKAVM为模板，应用建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR进行检测。

1.4.3 重复性试验 分别以浓度为1.0×10～1.0×10copies/μL的标准品pMD-AKAVS、1.0×10～1.0×10copies/μL的标准品pMD-AKAVM为模板，进行3次批内和3次批间的SYBR Green I荧光定量RT-PCR重复试验，即每个样品设3个重复。计算每个稀释度标准品的平均值、标准差（SD）和变异系数（CV），以评价SYBR Green I荧光定量RT-PCR的可重复性（马玲等，2014）。

1.5 蚊样品采集及分类

2019年6—10 月，在广西边境地区、口岸城市的防城港市、东兴市、北海市、宁明县、龙州县、大新县、靖西县及那坡县等8个市（县）采集阿蚊（760只）、伊蚊（41只）、按蚊（48只）和库蚊（3038只）共3887只，根据采样地和蚊种合并为139份，-80 ℃保存备用。

1.6 新型AKAV检测及变异分析

将139份蚊样品置于无菌EP管中，每份加入500～800 μL PBS，用组织研磨仪研磨蚊样品；12000 r/min离心20 min，取上清液；按照病毒RNA提取试剂盒说明提取病毒RNA，分别采用RT-PCR和SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测新型AKAV。同时，采用荧光定量RT-PCR引物AKAVSF/AKAVSR通过RTPCR扩增新型AKAV，回收阳性样品目的基因片段进行测序，采用ClustalW构建遗传进化树。

2 结果与分析

2.1 SYBR Green I荧光定量RT-PCR的建立

2.1.1 反应体系和扩增程序优化 根据t值、标准曲线、扩增效率及准确性等指标，确定新型AKAV的S基因和M基因SYBR Green I荧光定量RT-PCR最佳反应体系和扩增程序。其中，2对引物的最佳使用浓度均为4 μmol/L（图1），退火温度分别64和66 ℃（图2）；由于添加Mg对扩增结果影响不明显，故不再额外添加。即SYBR Green I荧光定量RTPCR最佳反应体系：SYBR Premix ExII 10.0 μL，上、下游引物（4 μmol/L）各1.0 μL，标准品或反转录产物2.0 μL，双蒸水补齐至20.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃30 s，64 ℃（S基因）/66 ℃（M基因）30 s，72 ℃30 s，进行40个循环。

2.1.2 标准曲线建立 采用优化的SYBR Green I荧光定量RT-PCR扩增梯度稀释的标准样品，每浓度标准品设3个平行。以标准样品拷贝数的对数值为横坐标、值为纵坐标，采用Excel 2013绘制标准曲线并计算相关系数。结果（表2）显示，新型AKAV的S基因、M基因分别在1.0×10～1.0×10copies/μL和1.0×10～1.0×10copies/μL间呈现良好的线性关系，对应的扩增效率分别为98.61%和105.81%。优化的SYBR Green I荧光定量RT-PCR敏感性好、检测范围宽，且无引物二聚体和非特异性扩增，适合临床检测。根据SYBR Green I荧光定量RT-PCR收集的荧光信号，若待测样品荧光信号超过阈值且≤35，同时扩增曲线为平滑的S形，则可判定待测样品中含有新型AKAV。

2.2 SYBR Green I荧光定量RT-PCR评价结果

2.2.1 检测特异性 选取牛、羊、竹鼠病原进行新型AKAV的S基因和M基因检测，结果发现蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、竹鼠圆环病毒和布鲁氏杆菌均不能有效扩增，仅新型AKAV扩增出对应的标准曲线（图3）。说明针对新型AKAV S基因和M基因设计的扩增引物可与新型AKAV特异性结合，但不能结合其他牛、羊、竹鼠病原，即建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR特异性强。

2.2.2 检测灵敏性及其范围 由图1可确定，SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测新型AKAV S基因和M基因的拷贝数范围分别为1.0×10～1.0×10copies/μL和1.0×10～1.0×10copies/μL，对应的检测限为1.0×10copies/μL和1.0×10copies/μL。

2.2.3 检测重复性 SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测新型AKAV S基因的批内重复试验CV为0.15%～2.88%，批间重复试验CV为0.49%～3.56%（表3）；SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测新型AKAV M基因的批内重复试验CV为0.16%～1.09%，批间重复试验CV为0.20%～4.35%（表4）。可见，建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR均具有较好的重复性。

2.3 广西边境地区蚊样品新型AKAV检测结果

采用建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR对139份广西边境地区蚊样品进行新型AKAV检测，结果表明，在采自防城港市（阿蚊和库蚊）、东兴市（库蚊）、北海市（阿蚊和库蚊）、宁明县（库蚊）和大新县（阿蚊）的蚊样品中检出新型AKAV S基因和M基因的荧光信号均超过阈值且≤35，同时扩增曲线（图4）呈平滑的S形，故判定这些蚊样品中含有新型AKAV。同时使用RT-PCR进行检测，结果也均呈阴性。

2.4 新型AKAV S基因变异分析结果

以来自防城港市、东兴市、北海市、宁明县及大新县的新型AKAV阳性样品为模板，采用RT-PCR扩增新型AKAV的S基因，分别命名为GX2019-FC、GX2019-Dox、GX2019-BH、GX2019-NM和GX2019-DX，并与近年来周边省份的AKAV毒株及国内外的AKAV代表毒株进行比对分析，结果发现这5株毒株均属于基因Ia型（图5），且与广西竹鼠源新型AKAV的相似性高达95.6%～100.0%，均为新型AKAV；与近年来云南、湖南、广东从迷糊蚊子、中华按蚊、三带喙库蚊和蠓虫分离毒株的相似性为87.4%～98.5%，尤其与广东和湖南的AKAV分离毒株相似性较高。

3 讨论

蚊子是蚊媒病毒的重要传播媒介，目前已知蚊子可传播包括乙型脑炎、登革热和寨卡等在内的300余种人兽共患传染病。其中，AKAV于1961年在日本首次被发现，之后相继在澳大利亚、韩国、美国、东南亚及非洲部分国家出现，1972—1975年曾在日本暴发而造成约42000头小牛出生缺陷（任鹏飞，2019）。AKAV于1994年首次在我国被报道，1996年在上海暴发导致大量胎牛死亡；目前已证实我国有24个省（市、区）暴发流行，其中广西的牛羊抗体阳性率高达54.11%（林俊等，2014）。广西拥有约800 km的边境线，边境地区主要位于北回归线以南，气候温暖、降雨丰沛，非常适合蚊虫孳生。随着“一带一路”倡议的提出，我国与东盟国家的贸易、人口流动越来越频繁，广西也成为多种新发和再发传染病的高危地区，不仅威胁着居民的公共卫生安全，还给动物疫病防控带来一定压力。

本课题组于2016年首次在广西竹鼠中分离获得新型AKAV，随后周边省份云南、四川、湖南、广东及海南也相继在蚊蠓中检出与新型AKAV高度同源的AKAV，但尚未证实广西蚊子携带有新型AKAV（Tang et al.，2017；宋颂，2018；范娜，2019；吴德等，2019；Cao et al.，2019）。唐海波等（2018）针对新型AKAV的M基因建立了RT-PCR检测方法，其最低检测限为1.0×10copies/μL。在此基础上，本研究针对新型AKAV的S基因和M基因建立SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法，最低检测限分别为1.0×10copies/μL和1.0×10copies/μL，更适用于检测病毒拷贝数低的样品，同时具有较好的特异性和重复性。采用建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR成功从广西边境地区防城港市、东兴市、宁明县、大新县及北海市的阿蚊和库蚊中检出新型AKAV。与周边省份不同，本研究在阿蚊中检出新型AKAV，但未在按蚊中检出，证实阿蚊也是新型AKAV的传播媒介。

此外，与云南分离株DHL10M110（GenBank登录号KY284023）相比，新型AKAV毒株GXLCH16-70在NSs蛋白氨基酸序列中存在2处氨基酸位点差异，即S22N和F70S。为此，设计S基因扩增引物（AKAVSF/AKAVSR），使扩增片段涵盖这2处氨基酸差异位点而用于毒株鉴别。除了可用于SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测外，AKAVSF/AKAVSR还能用于S基因片段克隆。本研究结果表明，从广西边境地区蚊样品中检出的AKAV毒株为新型AKAV，S基因变异分析结果显示这些毒株均属于基因Ia型，与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性，推测新型AKAV已在广西周边省份流行，但是否能感染牛羊尚有待进一步探究。

4 结论

针对新型AKAV S基因和M基因建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，更适用于检测病毒拷贝数低的样品。此外，从广西边境地区蚊样品中检出的AKAV毒株均为新型AKAV，属于基因Ia型，与广东和湖南蠓虫、中华按蚊、致倦库蚊分离毒株具有较高的相似性，推测新型AKAV已在广西周边省份流行。