阿胶抗黑色素生成作用机制研究

项晴 徐继业 孙霓 闫金红

（聊城职业技术学院 山东聊城 252000）

皮肤是机体表面最大的组织器官，既具有保护身体、排泄汗液、感觉冷热和压力的作用，又能保护体内多种组织器官免受机械性、化学性、物理性及病原微生物的侵袭。皮肤作为人体最外层组织，是机体衰老最直观的外在表现，分为自然老化和光老化。前者与年龄有关；后者多由于环境因素所致，受紫外线照射、季节变化、生活压力及疾病等因素影响，皮肤表现为皮格样改变，并出现明显的色素沉着。近年来，随着人们保健意识的逐步增强，对于衰老的研究日益增多。目前，皮肤抗衰老的治疗方式很多，而且效果不同，人们的接受方式也不同。天然药物治疗的最大特点是安全且有效，早在《伤寒论》之中就有“猪肤汤”等方剂，至今仍可用于皮肤保养，可见天然药物延缓皮肤衰老的历史悠久。医药产品用于促进皮肤健康已经有几个世纪了，护肤品在临床应用与美容用途方面都有重要的地位，含有天然成分的化妆品已经被广泛使用。但目前发现的生物活性化合物发展成为新的化妆品仍然是一个重要的挑战［1-2］。

阿胶为马科动物驴的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶，可促进细胞再生，升高失血性休克者之血压，改善体内钙平衡，防止进行性营养障碍，提高免疫功能等［3-5］。已有报道称其具有抗衰老、抗肿瘤、免疫调节、抗炎等作用［6-7］，但其在皮肤美白方面的研究机制未见报道。本文研究了DHG 在小鼠B16-F10 黑素瘤细胞中的抗黑色素作用，探讨了DHG对这些细胞的作用机制，及其在皮肤护理中的应用前景。

1 材料和方法

1.1 材料

阿胶购自东阿阿胶股份有限公司（中国山东），其余试剂均购自Sigma-Aldrich。小鼠黑色素瘤细胞系B16-F10（BCRC60031），来自于研究中心。胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素（P/S）与杜尔贝克的改良Eagle培养基（DMEM）购自Hyclone。

1.2 细胞培养及活力测定

将B16-F10 细胞细胞置于含10% 胎牛血清、50mg/mLP/S 的DMEM 培养基中，37℃、5%CO2培养箱中培养。将B16-F10细胞以5×105个/孔的密度接种于24孔板。用双蒸馏水或乙醇（1g/10mL）制备DHG提取物。孵育24h后，更换含不同浓度DHG的新鲜培养基，继续孵育24h，采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯四唑溴盐（MTT）法测定细胞存活率。用磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）洗涤，代之以MTT溶液，37℃孵育1h。用ELISA 阅读器（Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA）测定二甲基亚砜（DMSO）溶解的细胞在540nm 的吸光度下形成的甲臜。

1.3 皮肤分析

DHG与生理盐水（1g/9mL）研磨5min，3000×g离心10min，取上清1mL 加入滤纸（9cm×9cm）中。把含有DHG 或RO 水滤纸放在志愿者的左边或右边脸颊上，保持15min，然后用RO水清洗后。用镜头纸轻轻擦拭5min，然后用TD-3D 皮肤分析仪测试，分析DHG 对面部皮肤的斑点、皱纹和纹理面部皮肤的影响。

1.4 阿胶溶液对小鼠B16-F10 细胞中酪氨酸酶活性影响测定

由于酪氨酸酶是黑色素形成的重要关键，抑制酪氨酸酶是避免黑色素生物合成的常用方法［8］。测定DHG 对B16-F10 细胞酪氨酸酶活性的影响。以10mLDMEM（10%胎牛血清，50mg/mLP/S）完全培养基将（1～3）×105的细胞接种于在24 孔板上，用不同浓度的DHG处理48h。再用裂解缓冲液（0.1MPBS，pH值为6.8，含1%Triton X-100 和蛋白酶抑制剂）收集细胞。然后细胞被冷冻和解冻5 次而破坏。细胞裂解液14000g 离心15min，采用Bradford 法（Bio-Rad，Richmond，CA，USA）测定细胞裂解液上清液中蛋白浓度并归一化。预热至37oC后，每个样品50µl转移到的96孔板，然后与50µlL-DOPA（11mg/mL）在37oC 反应1h。在30min 内，475nm 处动态测定吸光度，测量酪氨酸酶活性。以摩尔吸光系数为3700（mol/l·cm）-1，来计算酪氨酸酶活性。酪氨酸酶活性单位定义为在标准测定条件下氧化1µMmin-1底物（L-DOPA）所需的酶量。对酪氨酸酶活性的抑制率（%）=（A-B）/A×100%。其中，A为未处理样品的吸光度，B为DHG处理样品的吸光度。

1.5 阿胶溶液对小鼠B16-F10细胞中黑色素含量测量

将B16-F10 细胞以5×105mL-1的密度接种于24 孔培养板，在37℃、5%CO2中孵育24h。在100MJ 紫外光照射下，用系列浓度的DHG 处理B16-F10 细胞24h。PBS 洗涤后，冷冻并解冻30min，12 000g 离心30min，60℃用100µl 1N NaOH 溶液处理30min。将80µl 的培养基转移到微板上，用黑色素标准曲线在405nm 的吸光度下测定黑色素含量。将一份80µl 的培养基转移到微孔板上，并在405nm处测定吸光度，采用标准曲线测定，测定细胞黑色素含量。

图2 DHG 处理对酪氨酸酶活性的抑制作用

2 结果

2.1 DHG对细胞活力的影响

研究了DHG对小鼠B16-F10细胞存活率的影响。用MTT法检测不同浓度处理后细胞的存活率。如图1所示，水提物中的DHG 浓度为0.5～1.0mg/mL 时，在此范围内DHG对B16-F10细胞也没有细胞毒性作用。

图1 MTT 法检测DHG 对细胞活力的影响

2.2 DHG对皮肤试验的影响

用DHG进行简单的治疗，有一定的护肤效果。通过皮肤分析，DHG 治疗后面部皮肤纹理、毛孔、皱纹、红斑明显改善（见表1）。

表1 DHG 对面部皮肤分析的影响

图3 DHG 对黑色素生成的抑制作用

2.3 DHG对酪氨酸酶的影响

比较了在100mJUVB照射下DHG处理的B16-F10细胞的酪氨酸酶活性。结果表明，与UVB 组相比，DHG（1mg/mL）两种提取物对酪氨酸酶活性的抑制均为10.7%～14.1%（见图2）。

2.4 DHG对B16-F10细胞黑色素含量的影响

为了进一步评价DHG 抗黑素的潜力，测定了在100 MJ UVB 照射下DHG 处理的B16-F10 细胞的黑色素含量。在处理后24h，用405nm的吸光度测量黑色素含量。结果表明，DHG水提液（1mg/mL）对黑色素的抑制活性为16.4%（见图3）。

3 讨论

本研究结果表明，DHG 对B16-F10 黑素瘤细胞的细胞存活率无细胞毒性作用。DHG 通过抑制酪氨酸酶活性，降低B16-F10黑色素细胞黑色素含量，具有抗黑色素生成作用。因此，从驴皮中提取的DHG有可能成为一种抗色素剂。

得出结论：阿胶对细胞没有细胞毒性，通过抑制酪氨酸酶活性，降低B16-F10黑色素细胞黑色素含量，具有抗黑色素形成作用。