补阳还五汤通过SIRT1/NF-κB p65信号通路减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤*

辛紫媛，靳晓飞，周晓红，刘真一，高 萍，马 娴，高维娟，△

（1承德医学院病理生理学教研室，河北承德 067000；2河北中医学院河北省心脑血管病中医药防治研究重点实验室，河北石家庄 050091）

脑卒中是急性脑血液循环紊乱的一类脑血管疾病，可导致全球范围内患者的高致残率和高死亡率，造成巨大的健康和经济负担，其中最常见的是缺血性脑卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）［1］。目前CIS的主要治疗方法有早期静脉注射组织型纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen aetivator，tPA）、血管内取栓、改善侧支循环等［2］。然而，在长时间的缺血条件下，血液发生再灌注可能会导致更大的脑梗死体积，反过来加重初始损伤产生继发性脑神经损伤，称为脑缺血/再灌注损伤（cerebral ischemia/reperfusion injury，CIRI）［3］。在CIRI 过程中可触发的一系列炎症级联反应会形成恶性循环，诱导神经细胞死亡，这些反应通过特定的炎症信号通路发出信号，导致缺血性脑组织产生炎症性病变，在CIRI 作用机制中起着至关重要的作用［4-5］。沉默信息调节因子1（silent information regulation 1，SIRT1）是哺乳动物Ⅲ类组蛋白脱乙酰基酶sirtuin 家族的一个重要成员，具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依赖的脱乙酰基酶活性，在CIRI 中可调节神经细胞存活、轴突伸长、突触可塑性决定细胞的命运，介导相关的信号通路参与保护神经系统疾病模型中的神经细胞免受损伤，其中包括抑制其下游的核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）核转位进而减轻炎症反应［6-7］。补阳还五汤（Buyang-Huanwu decoction，BYHWD）在清朝王清任所著的《医林改错·下卷·瘫痿论》一书中被首次提出，对症治疗气虚血瘀所致中风沿用至今，具有显著的疗效，但其确切的药理机制尚不清楚［8］。有研究表明BYHWD 含药血清能够有效延缓晚期衰老引起的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的异常迁移和侵袭，并伴随着基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）表达的减少，发现SIRT1 可能是影响其发生发展的关键因素［9］。同时，多项研究表明BYHWD 在抑制炎性细胞因子的产生和免疫紊乱调节方面发挥作用，减轻炎症反应缓解疾病进展［10］。本研究建立SD 大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型并给予BYHWD 干预，观察BYHWD 是否可以通过调节SIRT1/NF-κB p65 炎症信号通路发挥对CIRI 大鼠的神经保护作用，进一步探索BYHWD调节CIRI的可能作用机制。

材料和方法

1 动物

75只SPF级健康雄性SD 大鼠，7～8周龄，体质量250～280 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号为SCXK（京）2016-0011，适应性饲养7 d 后开始实验，所有实验动物给予人道关怀，实验严格遵循河北中医学院实验动物伦理审查标准，审核编号：DWLL2019025。

2 主要药物、试剂和仪器

TTC 染液、HE 染液和免疫组化试剂盒（武汉塞维尔生物科技有限公司）；SIRT1 抑制剂EX527（Selleck Chemicals）；兔抗SIRT1 抗体、兔抗NF-κB p65 抗体（Cell Signaling Technology）；兔抗NF-κB p65 acetyl K310 抗体（Abcam）；鼠抗IL-6 抗体、鼠抗TNFα 抗体（Santa Cruz）；辣根酶标记山羊抗兔IgG、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；蛋白酶抑制剂（Sigma）；QuickBlock™免疫染色封闭液、含DAPI抗荧光淬灭封片液、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、RIPA 裂解液（上海碧云天生物技术有限公司）；FITC-羊抗兔IgG 荧光标记抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；PVDF膜（Millipore）；

MCAO 栓线（北京西浓科技有限公司）；组织包埋机、轮转切片机、冰冻切片机及显微拍照系统（Leica）；电泳系统及半干转膜仪系统（Bio-Rad）；高速低温组织研磨仪（武汉塞维尔生物科技有限公司）；冷冻高速离心机、多功能酶标仪（Thermo）；多功能成像系统（Vilber）。

3 主要方法

3.1 实验动物的分组与给药 健康雄性SD 大鼠75只随机分为5 组：假手术（sham）组、模型组（MCAO/R组）、BYHWD组、SIRT1抑制剂组（EX527组）和BYHWDZ+EX527组，每组15只大鼠。除sham 组外，其余各组大鼠均参照文献［11］建立MCAO 模型模拟CIRI，手术缺血2 h 后再灌注3 d。BYHWD 组和BYHWD+EX527组大鼠给予BYHWD，剂量参照实验室前期研究［12］为14.3 g/kg。EX527 是一种SIRT1 特异性抑制剂，可有效抑制SIRT1 去乙酰化酶活性，EX527 粉末需要溶解在1%二甲基亚砜，20%聚乙二醇和79%双蒸水混合而成的溶剂中。EX527 组和BYHWD+EX527 组大鼠造模前开始腹腔注射给予EX527 溶液，剂量参照文献［13］为5 mg/kg。BYHWD 于造模后2 h 开始至取材前，每1 d 灌胃给药1 次；EX527 于造模前3 d开始至取材前2 h，每2 d腹腔注射给药1次。同样，设置EX527未经干预的sham 组、MCAO/R 组和BYHWD 组腹腔注射相同体积的二甲基亚砜和聚乙二醇溶剂作为对照。

3.2 Zea Longa 评分标准评价神经功能缺损状况大鼠清醒后根据Zea Longa 评分，将得到1、2、3 分的大鼠随机分配入组，其余剔除；MCAO 缺血2 h 再灌注3 d，观察神经功能缺损状况并记录各组大鼠评分。评分标准为：无神经功能缺损记为0 分；悬尾时对侧前爪不能伸展记为1 分；行走时向对侧转圈记为2 分；行走时向对侧倾倒记为3 分；无自主活动或意识丧失记为4分。

3.3 TTC 染色检测脑梗死体积百分比 所有大鼠经1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，立即取出脑组织冰冻后切成6 个2 mm 厚的冠状切片，浸泡在TTC 溶液中于37 ℃恒温箱避光染色30 min，然后在4%中性甲醛固定液中固定，隔天将组织切片按顺序放置，使用相机拍摄图像后应用Image J 软件计算缺血侧局部脑梗死体积占总体积百分比。

3.4 HE 染色观察大鼠脑组织病理学变化 大鼠麻醉后取出完整脑组织，4%中性甲醛固定液充分固定24 h 以上，梯度乙醇脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋后制备厚度约5µm 的石蜡切片。染色时切片脱蜡复水，苏木素染色后流水冲洗，苏木素分化液分化后流水冲洗，苏木素返蓝液返蓝后流水冲洗，伊红染液染色后流水冲洗，经脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下采集图像，观察各组大鼠脑组织皮质缺血半暗带区域病理学改变。

3.5 Western blot 检测SIRT1、乙酰化NF-κB p65（Ac NF-κB p65）、NF-κB p65 及IL-6 蛋白表达水平 冰上快速取出新鲜脑组织皮质缺血半暗带区域，用液氮处理之后冷冻贮存备用。检测时组织在冰冷裂解缓冲液（裂解液由RIPA、PMSF、Cocktail混合而成）中快速剪碎，并用低温研磨仪匀浆，离心后进行BCA法蛋白定量，其余上清液在loading buffer 中100 ℃煮沸变性。蛋白经过SDS-PAGE 分离，半干转法转移到PVDF 膜上；5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h，TBST 洗膜后在Ⅰ抗［SIRT1 抗体（1∶1 000）、Ac NF-κB p65 抗体（1∶1 000）、NF-κB p65 抗体（1∶1 000）、IL-6 抗体（1∶200）及内参照β-actin抗体（1∶2 000）］溶液中4 ℃孵育过夜，洗膜后与相应种属的Ⅱ抗［辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的IgG 抗体］室温孵育2 h，洗膜后ECL 显色剂避光孵育后曝光成像，使用VisionCapt凝胶成像系统采集图像。实验以β-actin 为内参照蛋白，通过观察目的蛋白与β-actin比值，乙酰化蛋白与总蛋白比值分析蛋白的相对表达水平。

3.6 免疫荧光染色检测NF-κB p65入核表达水平新鲜脑组织固定至少24 h，蔗糖溶液中梯度脱水，OCT 包埋剂包埋后制备厚度8 µm 的冰冻切片低温保存。染色时切片恢复室温后封闭液封闭，滴加Ⅰ抗NF-κB p65（1∶1 000）抗体于4 ℃冰箱中孵育过夜，洗片后滴加Ⅱ抗（FITC-羊抗兔IgG 荧光抗体，1∶100）室温避光孵育1 h，洗片后使用含DAPI 抗荧光淬灭剂封片避光保存，荧光显微镜下分别采集大鼠脑组织皮质缺血半暗带区域DAPI 图像和NF-κB p65 图像，将两种荧光图像融合分析细胞核内NF-κB p65荧光强度。

实习后期的主要压力源来自就业。实习后期，实习护生在应对日益繁重的实习任务之余，还需为未来做准备。当前就业的供需矛盾及部分护生过高的就业期望，使许多实习护生精疲力竭(“才发现护理专业也不是我们想象中那样好就业”[2]，“竞争那么激烈，找个编内工作实在太难了”[6])。

3.7 免疫组化染色检测TNF-α 表达水平 石蜡切片经脱蜡复水后，浸泡在柠檬酸抗原修复缓冲液中微波炉加热进行抗原修复，室温冷却后PBS 洗片；双氧水溶液避光孵育30 min 消除内源性过氧化物酶，PBS洗片；3%BSA 室温封闭30 min；Ⅰ抗TNF-α抗体（1∶50）湿盒内4 ℃孵育过夜，防止干片；次日PBS 洗片，Ⅱ抗（HRP-山羊抗小鼠抗体）室温孵育1 h，PBS洗片；滴加DAB 显色液并在显微镜下观察到阳性表达为棕黄色时，自来水洗片；苏木素复染细胞核，自来水洗片，苏木素分化液分化数秒，自来水洗片，苏木素返蓝液返蓝，自来水洗片；切片染色完成后脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察大鼠脑组织皮质缺血半暗带区域并采集图像。应用Image-Pro Plus 6.0 软件分析并计算平均光密度（average optical density）以评价蛋白表达水平。

4 统计学处理

采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 8.0.1 软件对所得实验数据进行分析并绘制柱状图。数据均采用均数±标准差（mean±SD）的形式表示。各组间比较采用单因素方差分析，组间均数的两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 Zea Longa评分观察不同处理组大鼠神经功能缺损状况

sham 组神经功能正常，其它各组大鼠均有不同程度的神经功能缺损；与sham 组相比，MCAO/R 组出现显著神经功能缺损状况，神经功能学评分升高（P＜0.05）；与MCAO/R 组相比，BYHWD 组神经功能缺损状况有所恢复，神经功能学评分降低（P＜0.05），EX527 组神经功能缺损程度加重，神经功能学评分升高（P＜0.05）；与BYHWD 组相比，BYHWD+EX527出现更严重的神经功能缺损状况，神经功能学评分升高（P＜0.05），见图1。

2 TTC染色观察不同处理组大鼠脑梗死体积改变

TTC 染色结果显示，sham 组脑组织呈均匀红色，无缺血梗死灶出现，其它各组大鼠均有不同程度的缺血梗死灶；与sham 组相比，MCAO/R 组缺血侧脑组织出现明显的白色缺血梗死灶，脑梗死体积百分比增加（P＜0.05）；与MCAO/R 组相比，BYHWD 组白色缺血梗死灶有所减小，脑梗死体积百分比降低（P＜0.05），EX527 组白色缺血梗死灶增大，脑梗死体积百分比增加（P＜0.05）；与BYHWD 组相比，BYHWD+EX527 组出现更大面积的白色缺血梗死灶，脑梗死体积百分比增加（P＜0.05），见图2。

Figure 1.Zea Longa score was used to observe the neurological deficits of the rats in different groups.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO/R group；△P＜0.05 vs BYHWD group.图1 Zea Longa评分观察各组大鼠神经功能缺损状况

3 HE染色观察不同处理组大鼠脑组织病理学变化

HE染色结果显示，sham 组脑组织皮质区结构正常，神经细胞排列整齐、细胞完整、数量丰富，细胞核清晰可见；与sham 组相比，MCAO/R 组脑组织缺血侧皮质区部分呈疏松的网状结构，神经细胞排列紊乱、完整性被破坏甚至萎缩、数量减少，核固缩、碎裂；与MCAO/R 组相比，BYHWD 组脑组织病理损伤减轻，神经细胞萎缩形态有所改善、数量增多；EX527 组脑组织病理损伤更为严重，呈疏松的网状结构、空泡状，神经细胞丢失、破裂甚至坏死，核溶解；与BYHWD组相比，BYHWD+EX527组脑组织病理损伤加重，神经细胞破坏程度有所增加，见图3。

4 Western blot 观察不同处理组大鼠SIRT1、Ac NF-κB p65、NF-κB p65和IL-6蛋白表达水平

与sham 组相比，MCAO/R 组SIRT1 表达显著降低，Ac NF-κB p65/NF-κB p65比值和IL-6表达显著升高（P＜0.05）；与MCAO/R 组相比，BYHWD 组SIRT1表达显著升高，Ac NF-κB p65/NF-κB p65 比值和IL-6表达显著降低（P＜0.05），EX527 组SIRT1 表达降低，Ac NF-κB p65/NF-κB p65 比值和IL-6 表达升高（P＜0.05）；与BYHWD 组相比，BYHWD+EX527 组SIRT1表达降低，Ac NF-κB p65/NF-κB p65比值和IL-6表达升高（P＜0.05），见图4。

5 免疫荧光染色观察不同处理组大鼠NF-κB p65入核表达水平

Figure 2.TTC staining was used to observe the cerebral infarction volume changes of the rats in different groups.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO/R group；△P＜0.05 vs BYHWD group.图2 TTC染色观察不同处理组大鼠脑梗死体积改变

Figure 3.HE staining was used to observe the brain histopathological changes of the rats in different groups.图3 HE染色观察不同处理组大鼠脑组织病理学变化

免疫荧光结果显示细胞核阳性表达为蓝色荧光标记，NF-κB p65 阳性表达为绿色荧光标记，NF-κB p65在细胞浆中表达处于无活性的静止状态，在细胞核中表达处于被激活的活性状态。sham组脑组织皮质区NF-κB p65 主要表达于细胞浆中；与sham 组相比，MCAO/R 组缺血侧脑组织皮质区NF-κB p65 主要表达于细胞核中，核内NF-κB p65 表达水平增加（P＜0.05）；与MCAO/R 组相比，BYHWD 组细胞浆和细胞核中NF-κB p65 均有表达，核内NF-κB p65 表达水平减少（P＜0.05），EX527 组核内NF-κB p65 表达增多（P＜0.05）；与BYHWD 组相比，BYHWD+EX527 组核内NF-κB p65表达增多（P＜0.05），见图5。

6 免疫组化染色观察不同处理组大鼠TNF-α 蛋白表达水平

免疫组化结果显示TNF-α 阳性表达主要集中在细胞浆中，呈棕黄色细颗粒状。sham 组脑组织皮质区仅有少量TNF-α 表达；与sham 组相比，MCAO/R 组TNF-α 表达量显著升高（P＜0.05）；与MCAO/R 组相比，BYHWD 组TNF-α 表达量有所降低（P＜0.05），EX527 组TNF-α 表达量增加（P＜0.05）；与BYHWD组相比，BYHWD+EX527 组TNF-α 表达量增加（P＜0.05），见图6。

讨 论

CIRI导致神经细胞损伤的机制是级联和多因素的，与炎症反应、氧化应激、自噬、内质网应激、细胞凋亡等多个环节密切相关，涉及到多种病理生理机制形成了复杂的调控网，威胁人类机体的健康产生严重损害作用，靶向这些机制显示有益的神经保护作用，探索减轻CIRI的发病机制、治疗方法和治疗药物是CIS治疗中的亟待解决的关键难点［14-15］。

炎症反应是CIRI 重要的发病机制，也是缺血脑组织继发性损伤的重要原因，贯穿了CIRI 的整个病理生理过程［16］。CIRI 会快速引起炎症反应，后者是免疫系统去除有害的感染性或非感染性刺激并启动愈合过程的生理性防御反应，过度的炎症反应不仅影响局部血液供应，还对神经细胞产生直接损伤，造成血脑屏障破坏，神经细胞进一步损伤［17-18］。早期死亡和受损神经细胞释放损伤相关分子模式（damageassociated molecular patterns，DAMPs）诱导中枢神经系统炎症细胞激活，包括小胶质细胞、星形胶质细胞的活化和外周白细胞（淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞）的渗出，这些炎症细胞会释放大量的炎症介质，如TNF-α 和IL-6 等促炎因子的产生，其过表达是炎症反应在CIRI 损伤的一个典型病理特征，主要炎症信号通路如NF-κB 和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）等信号通路通过调节这些炎症介质减轻CIRI［19-22］。因此，如何通过干预炎症反应，以影响CIS 患者的转归和预后，是值得关注的研究方向。

Figure 4.Western blot was used to detect the protein levels of SIRT1，Ac NF-κB p65，NF-κB p65 and IL-6 of the rats in different groups.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO/R group；△P＜0.05 vs BYHWD group.图4 Western blot检测不同处理组大鼠SIRT1、Ac NF-κB p65、NF-κB p65、IL-6的蛋白表达水平

随着近年来的研究表明，SIRT1在体内和体外都能保护机体改善CIRI，激活SIRT1 可以被认为是一种神经保护策略，有望成为越来越多心脑血管疾病有前途的治疗靶点［23］。Yeung 等［24］首次证明SIRT1作为去乙酰化酶，不仅可以去乙酰化组蛋白底物，还可以调节下游非组蛋白底物NF-κB 的转录活性进而调控细胞的生存。NF-κB 通常以p50/p65 异源二聚体形式存在，是启动炎症反应的核心和关键调控因子，生理状态下NF-κB与抑制蛋白IκB结合主要以非活性形式存在于细胞质中，在受到刺激后IκB 蛋白被磷酸化、泛素化及蛋白酶体降解，退化的IκB 与NF-κB 解离，使NF-κB p65 转移进入到细胞核被激活，促进炎性因子的产生，有效调控NF-κB 信号通路抑制其核转位是调控局灶CIRI早期炎性损伤至关重要的环节［25］。然而，NF-κB p65亚基需要经过多种翻译后修饰才能调控转录的激活［26］。在CIRI 发生后，调控SIRT1 靶点在缺血后炎症反应中起重要作用，SIRT1 可以通过抑制Ac NF-κB p65 310 赖氨酸残基乙酰化水平，减少NF-κB p65从细胞质转位到细胞核内，使NF-κB 的转录活性下降，阻止发挥促炎的活性作用，减少炎症因子TNF-α 和IL-6 的产生，以减轻炎症反应发挥保护作用［27-28］。

Figure 5.Immunofluorescence staining was used to observe the nuclear expression of NF-κB p65 of the rats in different groups.Blue represents DAPI positive signal；green represents NF-κB p65 positive signal.The scale bar=50 µm.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO/R group；△P＜0.05 vs BYHWD group.图5 免疫荧光染色观察不同处理组大鼠NF-κB p65入核表达情况

Figure 6.Immunohistochemical staining was used to observe the protein expression levels of TNF-α of the rats in different groups.The scale bar=50µm.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO/R group；△P＜0.05 vs BYHWD group.图6 免疫组化染色观察不同处理组大鼠TNF-α蛋白表达水平

在中医学上将脑卒中称之为中风，传统中药BYHWD 是临床上广泛应用、切合中风病机的一个中医经典名方。方中重用大剂量的黄芪益气固表为君药，当归活血化瘀佐君配合加入为臣药，其它单味药赤芍、红花、地龙、桃仁、川芎活血祛瘀通经活络均为佐药。用药主次分明，以补气为主兼以活血化瘀通络之功效，对症治疗气虚血瘀所致中风［29］。虽然BYHWD 在治疗脑卒中进程发展中被证明可降低炎症反应，但具体机制仍未明确［30］。

本研究表明，建立CIRI 在体MCAO 模型并于再灌注损伤早期给予BYHWD治疗，可减轻MCAO/R大鼠的神经功能缺损症状，降低脑梗死体积，减轻脑组织病理损伤。进一步的研究表明，其药理作用的具体机制可能通过激活SIRT1 降低Ac NF-κB p65 表达，抑制NF-κB p65 活性，减轻TNF-α 和IL-6 等促炎因子的表达，通过EX527 干预后，BYHWD 引起的这些作用被减弱。这提示BYHWD 可能通过调控SIRT1/NF-κB p65 炎症信号通路的潜在机制发挥其减轻CIRI 的药理作用，了解这种修饰方式可以更加精确调节NF-κB 的转录激活，以此作为靶点的抗炎治疗为BYHWD 治疗脑血管疾病提供更精准的理论基础。