郑迎春,汪 兰
(广东药科大学生命科学与生物制药学院,广东广州 510006)
据2020 年全球世界癌症中心数据统计显示,乳腺癌在女性肿瘤中的发病率居于首位,乳腺癌发病率一度超过肺癌,成为全球最常见的肿瘤[1]。随着临床诊断和治疗方法的不断发展,早期乳腺癌的治疗效果良好,但三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)因易转移和易复发而难以彻底治愈。探索TNBC的细胞特性有助于为其临床治疗提供理论依据[2]。
TNBC 占浸润性乳腺癌的10%~20%,是雌激素受体、孕激素受体和人类表皮生长因子受体2 均不表达的乳腺癌[3]。TNBC 生长迅速且侵袭性较强,易于复发使得预后较差[4]。目前,有大量针对特定受体或TNBC 靶向治疗的临床试验正在进行中,例如,聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]抑制靶向治疗的研究发现,PARP 抑制剂对BRCA1/2 缺陷型肿瘤具有显著的抗肿瘤作用,对BRCA1 突变型肿瘤的抑制作用比无此类突变肿瘤的抗肿瘤效果显著[5]。雌激素受体α36 在雌激素受体阴性乳腺癌细胞的细胞质和细胞膜中表达,参与调控乳腺癌细胞的恶性进程,存在正反馈环路,作为一个TNBC 治疗的潜在靶点正被深入研究[6]。同时,免疫治疗中的PD-L1和CAR-T疗法在TNBC 的临床治疗中也已由实验室研究迈向临床[7]。综上可知,找到TNBC的关键调控因子对于乳腺癌的靶向治疗和个性化治疗至关重要。
高尔基体是细胞内一个重要的膜性结构,执行多种重要的生物学功能[8]。酰基辅酶A 结合结构域蛋白3(acyl-CoA binding domain containing protein 3,ACBD3),又称GCP60、GOCAP1、GOLPH1 和PAP7,作为一个高尔基体衔接蛋白参与高尔基体结构和功能的维持[9]。研究发现,ACBD3 可参与类固醇代谢、细胞凋亡、铁平衡、胚胎发育及细胞周期调控[10-11]。高尔基体蛋白可用于临床筛查及预后判断,如胆管上皮细胞高尔基体蛋白73 可用于协助诊断肝纤维化和肝硬化[12];ACBD3 在非小细胞肺癌中表达上调预示较差的治疗效果。但ACBD3 在TNBC 增殖中的功能及机制尚不清楚。
磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)信号通路调控细胞增殖及存活,在肿瘤的发生、发展过程中至关重要[13-14]。叉头框蛋白O(forkhead box O,FOXO)转录因子受PI3K-AKT 信号通路负调控,经AKT 磷酸化后使其活性下降,在细胞增殖中起到负性调控作用[15]。然而,ACBD3 与增殖关键信号通路AKT 的关系尚无研究报道。本研究首次探讨了ACBD3通过活化AKT进而调控TNBC细胞的增殖。
人乳腺癌细胞系MCF-7、ZR-75-30、SK-BR-3、BT549 和MDA-MB-231 及永生化正常乳腺上皮细胞系MCF-10A均为中山大学热带病防治研究教育部重点实验室提供[16]。
DMEM 粉末、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和无血清角质细胞培养基(keratinocyte serum-free medium,KSFM)均购自Gibco;PCR 及逆转录试剂盒(Vazyme);鼠抗人ACBD3 抗体(sc-101277)购自Santa Cruz;鼠抗人GAPDH 抗体(ab8245)和兔抗人p-FOXO4Ser193抗体(ab174849)购自Abcam;MTT 粉末、ECL 发光液粉末和Hoechst 33342 细胞核染料(Sigma);兔抗人p-AKTSer473抗体(9271S)、p-AKTThr308抗体(4056S)、AKT 抗体(9272S)、FOXO4 抗体(9472S)、p-FOXO3aSer253抗体(9466S)、FOXO3a 抗体(9466S)、p-FOXO1Ser256抗体(9461S)、p-GSK3β(9322S)抗体和GSK3β 抗体(12456S),鼠抗人FOXO1 抗体(14952S)均购自Cell Signaling Technology;细胞周期检测试剂盒(RiboBio);BCA 蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher);ACBD3引物序列由金唯智生物科技有限公司合成。
3.1 细胞培养 MCF-7、ZR-75-30、SK-BR-3、BT-549 和MDA-MB-231 细胞均使用含10% FBS 的完全培养基进行培养,MCF-10A 细胞使用KSFM 培养基进行培养,将所有细胞置于37 ℃、5% CO2的培养箱中进行培养。
3.2 qPCR 和Western blot 验证乳腺癌细胞中ACBD3 的表达 胰酶消化接种于6 孔板中的MDAMB-231、BT-549 及MCF-10A 细胞,分别提取各组细胞的RNA 及蛋白,使用qPCR 及Western blot 法分别检测ACBD3 在各组细胞中的mRNA 和蛋白表达。ACBD3 上游引物序列为5'-ACAGTATCCAGGGAACTACGAA-3',下游引物序列为5'-GTTTCTGTAATGCTGCCGTTG-3';内参照GAPDH 的上游引物序列为5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3',下游引 物序列为5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。
3.3 构建沉默ACBD3的TNBC 细胞系模型 选取TNBC 细胞系MDA-MB-231 和BT-549,分为2 组:(1)对照(RNAi-Vector)组:转染RNAi-Vector 质粒,转染浓度为1 g/L,构建为MDA-MB-231-RNAi-Vector 细胞和BT-549-RNAi-Vector细胞;(2)ACBD3沉默(ACBD3-RNAi)组:转染ACBD3-RNAi 质粒,转染浓度为1 g/L,构建为MDA-MB-231-ACBD3-RNAi 细胞和BT-549-ACBD3-RNAi 细胞。ACBD3-RNAi 的序列为5'-AUUGAUGGCUGCCAGCAUACACCUC-3',所使用质粒载体为pSUPER.retro.puro(Oligoengine)[17]。本文中所使用的载体制备及实验技术均按Oligoengine 公司pSUPER载体实验指南操作。
3.4 MTT 法检测ACBD3 对乳腺癌细胞活力的影响 取对数生长期的MDA-MB-231和BT-549细胞及其构建成功的ACBD3-RNAi 细胞,分别以每孔2×103个接种于96孔板中,每组设置3个复孔,分别培养0、24、48、72 和96 h 后,每孔加入18µL MTT 溶液(浓度为5 g/L),放置于37 ℃孵育4~6 h,弃去上清,每孔加入160 µL 的DMSO 溶液,避光震荡使孔板底部蓝紫色结晶充分溶解,490 nm 波长处检测吸光度,使用GraphPad Prism绘制细胞生长曲线。
3.5 平板集落形成实验 取MDA-MB-231 和BT-549 细胞及其构建成功的ACBD3-RNAi 细胞,分别以每孔500 个接种于12 孔板中,置于37 ℃孵箱培养14 d,弃去上清,每孔加入500µL甲醇固定30 min,使用PBS 清洗2 次,加入1%的结晶紫溶液染色10 min,回收结晶紫溶液,并使用流动水冲洗孔板,直至清水无色后,室温晾干孔板,进行集落数目统计。
3.6 EdU 染色检测ACBD3 对乳腺癌细胞增殖的影响 取MDA-MB-231 和BT-549 细胞及其ACBD3-RNAi细胞,分别以每孔2×104个接种于12孔板中,细胞放置于37 ℃孵箱培养24 h,每孔加入200µL EdU标记物孵育2 h;使用PBS 清洗3 次,加入250 µL 的4%多聚甲醛固定30 min;使用PBS 清洗2 次,每孔加入300 µL 的5% Triton X-100,孵育10 min;使用PBS清洗2 次,加入250µL 的Apollo 荧光染料,避光孵育30 min;每孔加入250µL 的5%Triton X-100,孵育10 min,重复2 次;使用PBS 清洗1 次,每孔加入250 µL的Hoechst 33342染色液孵育30 min,使用PBS清洗2次;晾干细胞爬片,使用防淬灭封片剂进行封片,荧光显微镜20倍镜进行拍照。
3.7 流式细胞术检测细胞周期分布 将MDA-MB-231 和BT-549 细胞及其ACBD3-RNAi 细胞以每孔5×105个接种于6 孔板内,置于37 ℃、5% CO2培养箱内过夜,次日加入基础培养基同步化处理24 h 后换为含有10% FBS 的完全培养基处理24 h。使用不含EDTA 的胰酶消化细胞,每组细胞内加入1 mL 提前预冷的70%乙醇吹打混匀于4 ℃固定过夜。次日,使用PBS 清洗3 次,加入500 µL 染色液(RNase A 与PI 体积比为1∶9),重悬细胞并使用滤网过滤至流式管中染色30 min,激发波长488 nm 处上机检测各个细胞周期的变化。
3.8 构建小鼠荷瘤模型 皮下接种乳腺癌细胞至小鼠乳房垫,构建小鼠异种种植模型,每只接种2×106个MDA-MB-231 细胞及其ACDB3-RNAi 细胞或1×107个BT-549 细胞及其ACDB3-RNAi 细胞,注射体积均为100µL。实验终点结束后对小鼠进行脱颈处死,并剥离小鼠肿瘤进行拍照、称重及数据统计分析。
采用GraphPad Prism 5 软件进行统计分析,所有数据结果以均数±标准差(mean±SD)表示。两组间的比较在正态性检验之后用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA;Version 4.0.3;https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)。
本课题组先前研究通过TCGA(The Cancer Genome Atlas)公共数据库分析ACBD3在乳腺癌组织及正常乳腺上皮组织中的数据,发现ACBD3 在乳腺癌组织中的表达水平明显高于正常乳腺上皮组织[18]。本实验中,我们对乳腺癌病例中的TNBC和其他类型乳腺癌中的ACBD3 进行了分组对比分析。我们选取正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)和5 株乳腺癌细胞系(MCF-7、ZR-75-30、SK-BR-3、BT-549 和MDA-MB-231)并收集其RNA 及蛋白,利用qPCR 和Western blot 法分别检测ACBD3 的mRNA 及蛋白表达水平。实验结果表明,在所有乳腺癌细胞系中ACBD3 的mRNA 及蛋白表达水平均显著高于正常乳腺上皮细胞(P<0.05 或P<0.01),其中TNBC 细胞系MDA-MB-231及BT-549中ACBD3的表达水平比其他类型的乳腺癌细胞更高(P<0.01),见图1。
通过qPCR 和Western blot 实验验证TNBC 细胞系MDA-MB-231 和BT-549 及其ACBD3-RNAi 细胞中ACBD3 的表达水平(P<0.01),见图2A、B。MTT 实验结果证明,ACBD3 能够显著促进TNBC 细胞系MDA-MB-231 和BT-549 的生长速度,与RNAi-Vector组相比,敲减内源性ACBD3的表达能够显著抑制TNBC 细胞的生长(P<0.01),见图2C。平板集落形成实验结果证明,ACBD3 能够显著增加TNBC 细胞系MDA-MB-231 和BT-549 的集落形成能力,与RNAi-Vector 组相比,敲减内源性ACBD3的表达则能够显著抑制TNBC 细胞的集落形成能力(P<0.01),见图2D。EdU 细胞增殖检测结果证明,ACBD3 能够显著促进TNBC 细胞系MDA-MB-231 和BT-549 的增殖能力,与RNAi-Vector 组相比,敲减内源性ACBD3的表达能够显著抑制TNBC 细胞的增殖能力(P<0.01),见图2E。
Figure 1.The mRNA and protein levels of ACBD3 in normal breast epithelial cells and breast cancer cells were tested by qPCR(A)and Western blot(B).Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs MCF-10A group.图1 正常乳腺上皮细胞及乳腺癌细胞中ACBD3的mRNA及蛋白表达情况
流式细胞术结果证明,ACBD3 能够促进TNBC细胞系MDA-MB-231和BT-549的细胞周期进展。与RNAi-Vector 组相比,当敲减内源性ACBD3表达后,各组细胞中G0/G1期的比例增加,S 期的比例减少。与RNAi-Vector 组相比,MDA-MB-231 细胞的G0/G1期比例由35.05%增加至64.45%,S 期比例由36.80%减少至18.83%;BT-549 细胞的G0/G1期比例由35.82%增加至58.23%,S 期比例由40.63%减少至23.48%(P<0.01),见图3。
为进一步验证ACBD3 在小鼠体内的生物学功能,通过接种TNBC 细胞待其成瘤,观察各个细胞系中RNAi-Vector 组与ACBD3-RNAi 组小鼠肿瘤体积大小的变化情况。小鼠肿瘤实验结果证明,ACBD3能够促进小鼠体内肿瘤的生长。与RNAi-Vector 组相比,敲减内源性ACBD3表达能够显著抑制肿瘤细胞生长,见图4A。此外,通过测量记录小鼠肿瘤体积曲线及肿瘤重量发现,ACBD3 能够促进小鼠体内肿瘤的增殖及成瘤,与RNAi-Vector 组相比,敲减内源性ACBD3能够显著抑制肿瘤细胞增殖及成瘤(P<0.05或P<0.01),见图4B、C。
通过GSEA 发现ACBD3的高表达与AKT活化的基因群相关,与FOXO3 负调控的富集基因群相关(P<0.05 或P<0.01),见图5A。此外,Western blot 结果显示,ACBD3 能够促进AKT、GSK3β 及FOXOs 等蛋白的磷酸化。与RNAi-Vector 组相比,敲减内源性ACBD3的表达能够显著降低AKT、GSK3β 及FOXOs等蛋白的磷酸化水平(P<0.01),见图5B。
高尔基复合体是细胞执行生物学功能的重要场所,参与调节蛋白质和脂质的修饰,运输及分选[19]。ACBD3基因位于人类染色体1q42.12,其蛋白是一个高尔基体衔接蛋白,主要负责维护高尔基体的结构和功能,且在内质网输出蛋白的分选和修饰中起关键作用[20-21]。先前研究表明,ACBD3 可以与多种分子相互作用,如PI4KB、Golgin45、TBC1D22、PPM1L、DMT1、PKA、FAPP2、TUG、PARP-1和Numb以及一些细菌和病毒蛋白等[22]。微阵列数据显示,ACBD3 参与调控细胞周期,已有研究表明ACBD3 可通过调控不对称细胞分裂中的Numb信号通路,从而调控细胞周期[18,23]。除此之外,研究报道ACBD3 在病毒及细菌复制中发挥重要作用。但ACBD3 在乳腺癌细胞发生发展中的具体生物学功能及分子机制研究甚少。
Figure 2.ACBD3 promoted the proliferation of triple-negative breast cancer(TNBC)cells in vitro.A:the mRNA expression of ACBD3 in the indicated TNBC cells transfected with RNAi-Vector and ACBD3-RNAi was detected by qPCR;B:the protein expression of ACBD3 in the indicated TNBC cells transfected with RNAi-Vector and ACBD3-RNAi was detected by Western blot;C:the cell viability was measured by MTT assay;D:the growth of the cells was detected by colony formation assay;E:the proliferation of TNBC cells was detected by EdU staining.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs RNAi-Vector group.图2 ACBD3可促进三阴性乳腺癌细胞增殖
已有的研究发现,TNBC 中通常伴有PTEN、TP53、PIK3CA、KRAS、BRAF、EGFR、FGFR1、FGFR2、IGFR1、KIT或MET等突变[24]。例如PTEN是10q23染色体上的肿瘤抑制基因,是PI3K-AKT 信号通路激活的关键调控因子之一,而PI3K-AKT 信号通路参与多种肿瘤的发生发展过程,其也是乳腺癌预后判断的重要分子[25]。此外,有研究发现ACBD3 可通过调节PI4Kβ 从而参与调控细胞自噬[10]。在多种肿瘤中沉默ACBD3或PRKAR1A(protein kinase A regulatory subunit type 1A)表达可诱导肿瘤细胞的生长抑制和凋亡,并伴有丝裂原活化蛋白激酶、PI3K-AKT 和JAK-STAT 等通路信号传导的减少[26-28]。本研究发现,ACBD3 在TNBC 细胞中的表达水平高于其他类型乳腺癌细胞,通过细胞生物学实验证明ACBD3 能够促进TNBC细胞生长及增殖。
FOXO 转录因子受PI3K-AKT 信号通路负调控,被认为对细胞增殖有抑制作用[27]。FOXOs 的4 种亚型(FOXO1、FOXO3、FOXO4 和FOXO6)具有较高的蛋白同源性,均受到AKT 蛋白调控[29]。FOXO1、FOXO3 和FOXO4 转录因子可被AKT 直接磷酸化并被抑制转录,在AKT 调控细胞增殖的过程中发挥着重要作用[30]。本研究发现ACBD3 能够调控AKTFOXOs 信号通路促进TNBC 细胞的增殖能力,沉默内源性ACBD3则能够抑制其增殖能力。
综上所述,本研究发现ACBD3 在TNBC 细胞中高表达,能够通过AKT-FOXOs 信号通路调控TNBC细胞的增殖能力,在TNBC的发生发展中发挥着重要作用。
Figure3.ACBD3 promoted the G1/S phase progression of triple negative breast cancer(TNBC)cells in vitro.The G1/S phase progression of TNBC cells was detected by flow cytometry analysis.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs RNAi-Vector group.图3 ACDB3促进三阴性乳腺癌细胞G1/S期转变
Figure 4.ACBD3 promoted the proliferation of triple negative breast cancer cells in vivo.A:tumor photos analysed by Canvas;B and C:analysis of tumor volume and weight by GraphPad Prism.Mean±SD. n=6.*P<0.05,**P<0.01 vs RNAi-Vector group.图4 ACBD3体内促进三阴性乳腺癌细胞增殖
Figure 5.The effect of ACBD3 on AKT-FOXOs pathway in triple negative breast cancer cells.A:the results of gene set enrichment analysis(GSEA)showed that ACBD3 expression was positively correlated with proliferation and cell cycle-activated gene signatures(ACBD3-H:high expression of ACBD3;ACBD3-L:low expression of ACBD3);B:the protein levels of AKT,GSK3β and FOXOs were examined by Western blot.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs RNAi-Vector group.图5 ACBD3对三阴性乳腺癌细胞中AKT-FOXOs信号通路的影响