阳虚寒凝型兔膝骨关节炎模型建立初探

桂 苗，施珊妮，黄泽灵，何俊君，李田花，洪振强，3*

（1.福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学杂志社，福建 福州 350122；3.中医骨伤及运动康复教育部重点实验室，福建 福州 350122；）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是一种常见的慢性退行性病变，临床上以膝关节疼痛、肿大、僵硬伴关节功能障碍等症状为主要表现，所引起的活动障碍和长期慢性疼痛严重降低患者的生活质量［1］。《中医病证诊断疗效标准》［2］将KOA分为肾虚髓亏、阳虚寒凝、瘀血阻滞3个证型，其中阳虚寒凝型是临床常见的证型［3-4］。故本实验采用关节腔注射木瓜蛋白酶、薄荷油灌胃联合恒温恒湿培养箱建立兔阳虚寒凝型KOA模型，并进行中医证型探讨，为KOA中医证候病理研究建立动物模型提供参考。

1 实验材料

1.1 实验动物 4月龄健康新西兰大白兔24只，体质量（2.0±0.5）kg，雌雄各半，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：［SCXK（沪）2017-0008］，委托福建中医药大学实验动物中心代购并饲养，动物使用许可证号：［SYXK（闽）2020-0003］。实验前均适应性喂养1周。

1.2 实验药物与试剂 薄荷油（上海源叶生物科技有限公司，批号：S24778）；木瓜蛋白酶（美国Sigma公司，批号：P8150）；苏木精-伊红染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：G1120-3）；白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA试剂盒（上海西唐生物科技有限公司，批号：MM-030501、MM-024001）。

1.3 实验试剂及仪器 自动脱水机、组织包埋机、光学显微镜均购自德国Leica公司；酶标仪（芬兰Thermo公司）；肛温计（深圳市米乐仪器有限公司）；脉搏血氧仪（上海市贝瑞电子科技有限公司）；恒温恒湿培养箱（天津市宏诺仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 动物分组 将24只4月龄新西兰大白兔按随机数字表法分为正常组、木瓜蛋白酶组、阳虚组、阳虚寒凝组，每组各6只。

2.2 模型建立 造模周期共4周。正常组不予干预，常规饲养；其余3组分别在第1周的第1、4、7 d采用关节腔内注射4%木瓜蛋白酶溶液0.1 mL建立KOA模型［5-6］，造模前1 d，进行膝关节周围备皮，造模时，消毒膝关节后注射木瓜蛋白酶溶液0.1 mL至关节腔，注射后再次消毒，用棉球压住针眼，多次屈伸膝关节使木瓜蛋白酶溶液充分浸润至整个膝关节腔内；阳虚寒凝组从第1周开始持续4周每日置于湿度为50%～60%、温度为4～6℃、体积为1.2 m×1.2 m×1.8 m的恒温恒湿培养箱中不限活动1.5 h［7］，第3周予以0.65 mL/（kg·d）薄荷油连续灌胃2周建立阳虚寒凝模型［8-9］；阳虚组第3周开始予以0.65 mL/（kg·d）薄 荷 油 连续 灌 胃2周 建 立 阳 虚模型。

2.3 取材 造模结束后隔日取材，取材前12 h动物禁食不禁水，予3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉。将麻醉后兔子仰卧固定于手术台上，用手术刀沿膝关节正中线划开皮肤，逐层分离肌肉，切断髌韧带，充分暴露膝关节囊后抽取关节液，将抽取的关节液迅速注入Ep管，并置于-80℃冰箱保存待测。取下膝关节滑膜组织和软骨组织，滑膜组织用4%多聚甲醛固定后流水冲洗，常规包埋；软骨组织用4%多聚甲醛固定后流水冲洗，常规脱钙、包埋。

2.4 KOA模型检测指标及方法

2.4.1 膝关节滑膜、软骨病理形态学观察 将包埋后的滑膜、软骨组织切片，苏木精-伊红（HE）染色后脱水、透明、固封，光镜下观察滑膜、软骨组织的形态学改变。

2.4.2 膝关节软骨损伤程度评价 采用改良Mankin's评分法对KOA模型膝关节软骨损伤程度进行评价［10］，主要评价软骨组织的结构、染色、潮线、细胞数量。分数越高，表示关节软骨损伤越严重。

2.4.3 膝关节周径测量和Lequesne MG评分 取材当天用皮尺测量4组兔膝关节周径，观察兔膝关节肿胀疼痛程度和屈伸功能，采用Lequesne MG评分［11］评估膝关节功能。

2.4.4 关节液中IL-1β、TNF-α含量检测 取出冻存的关节液，采用ELISA法检测关节液中IL-1β、TNF-α含量。

2.5 阳虚寒凝模型指标评定 测定兔体质量、肛温、心率及计算中医证候评分。取材前称取4组兔体质量，采用肛温计测量兔肛温，采用脉搏血氧仪测量兔心率。参照《辨证论治实验方法学：实验小鼠诊法与辨证》［12］，以表1、表2所列的症状及权重对阳虚症状和寒凝症状进行评分（权重=评分），评分由2名主治中医师独立评定，意见不一致时通过讨论并与第3名主治中医师商议决定。

表1 阳虚症状及权重

表2 寒凝症状及权重

2.6 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件进行数据处理。计量资料符合正态性分布的以（±s）表示，方差齐采用单因素方差分析中LSD-t法，方差不齐采用Games-Howell法。

3 结 果

3.1 4组膝关节软骨病理形态学比较 正常组软骨组织切线层连续且完整，移行层中软骨细胞纵向条索状分布且排列规律，辐射层、钙化层结构完整，层次清晰；木瓜蛋白酶组、阳虚组、阳虚寒凝组软骨组织表面不规整，纤维方向出现偏移、变薄，软骨细胞排列紊乱。见图1。

图1 4组膝关节软骨病理形态学比较（HE染色，×50）

3.2 4组膝关节滑膜病理形态学比较 正常组滑膜表面平整，滑膜衬里细胞为一层，衬里下层细胞排列疏松，无纤维组织、血管增生，无炎性细胞浸润；木瓜蛋白酶组、阳虚组、阳虚寒凝组滑膜表面不平整，滑膜衬里细胞层数增生明显，衬里下层细胞排列紊乱，有纤维组织增生和炎性细胞浸润。见图2。

图2 4组膝关节滑膜病理形态学比较（HE染色，×100）

3.3 4组膝关节软骨损伤改良Mankin's评分比较 正常组改良Mankin's评分为（0.33±0.21）分，木瓜蛋白酶组、阳虚组、阳虚寒凝组改良Mankin's评分分别为（8.17±0.31）、（7.33±0.21）、（7.00±0.26）分。与正常组比较，木瓜蛋白酶组、阳虚组、阳虚寒凝组改良Mankin's评分均显著升高（P均＜0.05）。

3.4 4组膝关节周径、Lequesne MG评分、关节液中IL-1β和TNF-α含量比较 见表3。

表3 4组兔膝关节周径、Lequesne MG评分、关节液中IL-1β和TNF-α含量比较（±s）

表3 4组兔膝关节周径、Lequesne MG评分、关节液中IL-1β和TNF-α含量比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与木瓜蛋白酶组比较，2）P＜0.05。

组别正常组木瓜蛋白酶组阳虚组阳虚寒凝组n6 6 6 6周径/cm 11.217±0.221 12.508±0.1351）12.517±0.2671）12.508±0.1291）Lequesne MG评分/分0.500±0.224 4.667±0.2111）4.833±0.1671）5.333±0.2111）2）IL-1β/（ng/L）61.488±5.041 116.113±2.2661）110.067±3.2221）115.472±2.4321）TNF-α/（ng/L）48.115±4.430 115.173±3.0311）115.210±3.8591）116.225±3.4311）

3.5 4组阳虚寒凝模型指标比较 4组兔体质量、肛温、心率、中医证候评分比较见表4。

表4 4组兔体质量、肛温、心率、中医证候评分比较（±s）

表4 4组兔体质量、肛温、心率、中医证候评分比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与木瓜蛋白酶组比较，2）P＜0.05；与阳虚组比较，3）P＜0.05。

组别正常组木瓜蛋白酶组阳虚组阳虚寒凝组n6 6 6 6体质量/kg 2.57±0.05 2.48±0.03 2.35±0.031）2）2.24±0.051）2）肛温/℃38.633±0.088 38.783±0.101 37.817±0.2441）2）37.267±0.1171）2）心率/（次/min）232.500±6.318 251.333±5.880 207.500±6.9991）2）184.167±10.0881）2）3）中医证候评分/分12.500±4.958 30.000±3.992 78.500±2.9971）2）109.833±5.2501）2）3）

4 讨 论

4.1 中医证候模型指标判定 参考《辨证论治实验方法学：实验小鼠诊法与辨证》［12］建立动物模型中医证候评价表，从中挑选出符合阳虚寒凝证的症状，将其分为阳虚和寒凝2类症状，2类中的相同症状，选取阳虚症状及权重表中权重进行计分。以蜷缩、精神萎靡、迟钝、倦怠、呼吸减弱、躯体移动减弱、体温降低等症状判定寒凝证；以唇、耳、毛淡，小便色淡，尾、爪凉，毛发稀少无光泽，心率减慢等症状判定阳虚证。

4.2 KOA模型判定 本研究结果显示：与正常组比较，木瓜蛋白酶组、阳虚组、阳虚寒凝组膝关节周径、Lequesne MG评分均升高，膝关节均出现肿胀、疼痛、屈伸功能障碍，关节液中IL-1β、TNF-α含量明显升高，表明膝关节腔内存在炎症；3组膝关节病理切片显示滑膜有炎症性改变，软骨损伤明显，改良Mankin's评分升高，提示膝关节滑膜和软骨均有损伤［13］。这表明关节腔注射木瓜蛋白酶能够成功建立KOA模型。

4.3 阳虚寒凝证判定 本研究结果显示：与正常组、木瓜蛋白酶组比较，阳虚组与阳虚寒凝组的阳虚寒凝症状评分显著升高，体质量、肛温与心率显著降低；与阳虚组比较，阳虚寒凝组体质量、肛温、心率降低更显著。这表明阳虚寒凝组符合阳虚寒凝证候特征，阳虚寒凝模型建立成功。

4.4 不足之处分析 本研究探讨阳虚寒凝的建立是通过中医证候评分比较，探讨中医动物模型的建立。但表格中的症状难以全部依靠肉眼观察，且仅凭肉眼观察难以有科学精准的评价；权重和评分之间缺乏客观的统一标准，而客观的评价标准对于动物模型的计量化辨证具有重要的意义。在建立中医证候评分表上，后续还需要查阅大量资料，结合人体临床表现以及实验动物特征，将中医证候评分表进行细化，为后续中医证候的动物模型建立提供量化的指标参考。