冷暴露诱导TLR2 和TLR4 小鼠腹腔原代中性粒细胞形成NETs 的初步研究

鞠憬，徐彬，刘洋，曹禹，胡亚捷，周万慧，杨玉英，李士泽

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

中性粒细胞（Polymorphonuclears，PMNs）作为免疫系统中第一个迁移到炎症部位的细胞，是固有免疫系统中含量最丰富的一类先天免疫效应细胞；被激活后可通过吞噬作用、脱颗粒以及一种不同于细胞死亡的新形式，中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）的方式参与机体免疫[1-2]。它一旦从血液中被招募到感染部位，就会迅速发挥其功能，NETs 是它对抗潜在病原体的第三种机制，这也是它对微生物和无菌炎症的反应，更是一种独特的细胞程序性死亡，称为嗜中性粒细胞病。在此过程中组蛋白、颗粒蛋白和细胞质蛋白包裹的核源解浓缩DNA 的网状结构挤压到细胞外空间。由于细胞外染色质原纤维可以缠绕微生物，这种结构被称为NETs。它作为中性粒细胞发挥生物学作用的另一种表现形式早在1996 年外国学者TAKEI 等描述了通过丙二醇甲醚醋酸酯（1-Methoxy-2-propyl acetate，PMA）刺激中性粒细胞产生的独特现象，进而发现了一种不同于细胞凋亡和坏死的新途径。有研究显示，细菌、干扰素、缺氧、佛波酯等均可刺激PMNs 生成NETs[3-4]。冷空气作为北方地区主要的应激源之一严重影响畜牧业的发展。当寒冷刺激发生时，处于冷应激状态的动物体将启动一系列非特异性的固有免疫反应来响应刺激，在此过程中会引起免疫细胞的活化，破坏动物体免疫功能[5-6]。

冷暴露作用于机体时可激活MyD88 介导的调控途径，启动下游的NF-κB 通路促进炎症物质和细胞因子的释放进行免疫调节作用，toll 样受体2、4 在此过程中起关键性作用[7-8]。ANCA 相关性小血管炎发病过程当中伴随有NETs 的形成，而这一过程主要依赖于TLR2、TLR4 模式识别受体[9]；而在慢性阻塞性肺疾病患者的外周血PMNs 中也有表述TLR2、TLR4的表达上调[10]；那么作为主要的模式识别受体TLR2、TLR4 被敲除的情况下对NETs 形成中的影响还未见有关报道。

因此，研究通过使用TLR2、TLR4 基因敲除小鼠，给予冷刺激后提取腹腔原代PMNs 的方法探讨了冷暴露能否诱导NETs 的形成，以及TLR2、TLR4 在此过程中的作用，进而为深层次的研究冷应激对NETs 的作用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物分组与细胞培养

试验使用的小鼠均为C57BL/6 8 周龄SPF（Specific pathogen free，SPF）级雄性TLR2 和TLR4 基因敲除小鼠，体重为28~30 g，均购自美国Jackson 实验室。且试验动物均已获得黑龙江八一农垦大学伦理委员会批准。

将TLR2 和TLR4 基因双敲除小鼠随机平均分为常温对照组（n=4）和4 ℃冷暴露组（n=4，4 ℃人工气候室中饲养3 h·d-1），连续刺激一周后全部处死，提取腹腔原代PMNs；加入于RPMI 1640 培养基中，并置于5% CO2、37 ℃培养箱内培养。

1.1.2 主要试剂

小鼠骨髓中性粒细胞分离试剂盒（天津灏洋华科生物科技有限公司，中国）；SytoxTMGreen（Thermo Fisher，美国）；抗荧光淬灭Hoechst33342 封片液（碧云天生物技术有限公司，中国）；MPO 单克隆抗体、山羊抗兔荧光二抗（武汉三鹰生物技术有限公，中国）；CitH3 单克隆抗体（Abcam，英国）；RPMI Medium 1640 basi（Invitrogen，美国）；WizardGenomic DNA Purification Kit、GoTaqMaster Mixes （Promega，美国）；RPMI Medium 1640（Solarbio，中国）；dsDNA HS Assay Kit for Qubit（上海翊圣生物科技有限公司，中国）。

1.2 试验方法

1.2.1 普通PCR

取尾组织作为样本，按说明书步骤操作提取DNA 模板进行PCR 反应，以TLR2 和TLR4 双敲除小鼠的KO 型基因与野生型（WT）基因做对照。PCR反应总体系（25μL）：酶12 μL；上下游引物各1 μL（序列见表1）；DEPC 水10 μL；DNA 模板1 μL。

表1 TLR2 和TLR4 特异性引物序列Table 1 TLR2 and TLR4 specific primer sequences

TLR2 基因KO 型与WT 型PCR 程序为：Lid，105 ℃；95 ℃，5 min；95 ℃，1 min；56 ℃，1 min；72 ℃，1 min；Repeat back to step 2，40 个循环；72 ℃，5 min；后于4 ℃保存。

TLR4 基因KO 型与WT 型PCR 程序为：Lid，105 ℃；95 ℃，5 min；95 ℃，1 min；60 ℃，1 min；72 ℃，1 min；Repeat back to step2，40 个循环；72 ℃，5 min；后于4 ℃保存。

将仪器调制400 mA，200 V 后，加入TLR2 和TLR4 基因KO 型与WT 型的PCR 扩增产物10 μL，在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳。

1.2.2 小鼠腹腔原代PMNs 的分离

抽取1 mL 7.5%的酪蛋白溶液于注射器中水浴加热，注入小鼠腹腔内。24 h 后收集PMNs，将试验小鼠处死置于解剖板上，消毒后做浅腹部中线切口，暴露出完整的腹膜。注射5 mL PMNs 分离培养基，轻轻的按摩腹膜腔以去除附着的PMNs 抽出腹腔灌洗液，按照PMNs 分离试剂盒说明书提取灌洗液中的PMNs 用于后续实验。

1.2.3 扫描电镜

哀乐又一次响起在这屋里，阿东被这悲哀之声压迫得透不过气。但阿里却立即把头伸出被子。他的脸上露出平静表情。仿佛真的是在听母亲的声音。他不说话，只侧耳倾听。

将分离的小鼠腹腔原代PMNs，均匀接种到有细胞爬片的24 孔板中培养，2 h 贴壁后，使用2.5%戊二醛固定6 h；PBS 缓慢冲洗3 次。进行浓度为30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精梯度脱水各浓度脱水2 次，5 min·次-1。乙酸异戊脂置换处理30 min 后进行临界点干燥；并粘于样品台上导电处理。处理后的爬片通过扫描电子显微镜获取图像。

1.2.4 NETs 的产量检测

使用dsDNA QubitR对NETs 进行定量。将PMNs加入96 孔板（1×105个·孔-1）培养2 h，更换培养基（无酚红无血清的1640）培养3 h。收集培养液离心，取上清加入染料孵育5 min 后，通过荧光酶标仪检测荧光值，并计算出cfDNA 的浓度。

1.2.5 蛋白质免疫印迹

提取原代PMNs 总蛋白，使用BCA 蛋白质定量试剂盒测量并计算浓度，并将其调成一致。将处理好的样品进行SDS-PAGE 凝胶电泳分离，根据Marker大小切去多余的胶后，将其转到PVDF 膜上。5%的脱脂乳封闭（此步骤后，每进行下一步骤前均需洗脱残留物3 次，10 min·次-1）；加入按1∶600 稀释的MPO、1∶1 000 稀释的CitH3 的一抗4 ℃摇床孵育过夜；再加入按1∶10 000 稀释的对应的二抗孵育1 h。将处理好的膜放入化学放光成相仪器中观察，用Image Lab软件进行灰度值分析。

1.2.6 统计学分析

2 结果与分析

2.1 小鼠TLR2、TLR4 基因型鉴定

TLR4 基因的KO 型和WT 型条带大小分别为140、390 bp。TLR2 KO 和WT 基因条带大小分别为334、499 bp。从图1 中A 可以看出1~8 号均在140 bp处有条带，10~17 号在390 bp 处均无条带出现。图B中1~8 号均在334 bp 处有条带，10~17 号在499 bp处均无条带出现。

图1 KO 小鼠TLR2 和TLR4 基因型的鉴定Fig.1 Identification of TLR2 and TLR4 genotypes in KO mice

2.2 冷暴露对TLR2、TLR4 基因敲除小鼠腹腔原代PMNs 形态变化的影响

为了确定冷暴露对NETs 形成的影响，通过扫描电镜的方法在在超显微立体结构上对PMNs 的形态结构进行观察。如图2 中A B 所示，结果发现与常温对照组的PMNs 相比，冷暴露组的细胞表面发生明显的褶皱和皱缩现象，并且在红色箭头标记处有明显的类似与伪足的结构被释放，并向周围延展；而常温对照组的PMNs 表面相对光滑没有伪足生成。

2.3 冷暴露对TLR2、TLR4 基因敲除小鼠腹腔原代PMNs 形成NETs 数量的影响

通过检测PMNs 释放到上清液中cfDNA 浓度的方法对NETs 进行定量分析，PicoGreen 染色后放入荧光酶标仪中检测，结果如图3 所示，与常温对照组相比，冷暴露组的PMNs 上清液中cfDNA 浓度明显升高，且差异显著（P<0.001）。

图3 冷暴露对TLR2、TLR4 基因敲除小鼠腹腔原代PMNs 形成NETs 数量的影响Fig.3 The effect of cold exposure on the number of NETs formed by primary PMNs in the abdominal cavity of TLR2 and TLR4 knockout mice

2.4 冷暴露对TLR2、TLR4 基因敲除小鼠腹腔原代PMNs 形成NETs 组件蛋白表达水平的影响

蛋白质免疫印迹结果显示，与常温对照组相比冷暴露组的NETs 组件蛋白CitH3、MPO 的蛋白表达水平均有显著升高（P<0.01、P<0.001）。

图4 冷暴露对TLR2、TLR4 基因敲除小鼠腹腔原代PMNs 形成NETs 组件蛋白表达水平的影响Fig.4 The effect of cold exposure on the protein expression level of NETs component ofprimary PMNs in the abdominal cavity of TLR2 and TLR4 knockout mice

3 讨论

寒冷刺激是东北部主要应激源之一，长期暴露在冷环境中机体会表现出一系列不良反应，以至于生长发育和免疫系统受到不同程度的损伤。研究显示，寒冷应激状态持续发生时会增加各种疾病感染的风险以及引自身抵抗力衰减等症状[11-12]。免疫细胞，特别是PMNs 形成的NETs 是理解免疫血栓形成的核心。它作为先天免疫的前哨细胞，负责防御宿主杀灭入侵的微生物。有研究表明，中性粒细胞胞外诱捕网微粒复合物是中性粒细胞募集的有效诱导物，此过程依赖于微粒上表达的高迁移率族蛋白1，并通过TLR2 和TLR4 介导来共同完成[13]。sTLR9+ PMNs亚群中主要对TLR9 介导的全身性炎症反应起保护作用的关键受体[14]；那么TLR2 和TLR4 被敲除后对冷暴露条件下的PMNs 以及形成NETs 的能力有什么影响仍需进一步研究。因此，试验选用TLR2 和TLR4 基因敲除小鼠并对其进行基因型的鉴定，确定基因成功敲除后在4 ℃人工气候室中饲养并提取腹腔原代PMNs 进行以下试验。

为进一步确定冷暴露对TLR2 和TLR4 基因敲除小鼠腹腔原代PMNs 形态结构和形成NETs 的影响以及与TLR2、TLR4 的联系，我们利用扫描电镜进行了显微结构上的形态学检测。有相关数据显示，患有乳房炎的奶牛所产出的奶中的中性粒细胞发生变形，同时有NETs 的形成，其形态呈现出向周围伸展出伪足的变化[15]。在Mori Yuka 等[16]发表的一文中NETs 有相同的形态表现。实验结果显示，与常温对照组相比冷暴露组的PMNs 表面发生明显的皱缩现象、伴有类似于伪足结构的NETs 向四周延伸，且与以上研究所得结果一致。说明了冷暴露能够改变PMNs 的形态，并诱导其生成并释放NETs，且此过程不受TLR2、TLR4 基因介导的途径调控。

NETs 主要由核酸和颗粒蛋白构成，其中颗粒蛋白附着在以DNA 为骨架的纤维网状结构上是发挥主要功能的物质，主要包括具有抗菌作用的中性粒细胞弹性蛋白（Neutrophil elastase，NE）、CitH3、MPO、组织蛋白酶G 等[17-19]。cfDNA 作为NETs 的主要核酸成分，在其它研究领域也备受关注。比如血浆cfDNA水平升高可预测脓毒症患者多器官功能障碍[20]。在重症肺炎患者的血浆cf-DNA/NETs 水平与预后进程紧密相关[21]。同样在NETs 参与调节急性力竭及规律有氧运动相关天然的作用[22]的一文中cfDNA 也作为关键的检测指标。因此，研究通过检测cfDNA 的浓度来定量分析在冷暴露条件下NETs 的生成数量，结果显示与常温对照组相比冷暴露组TLR2、TLR4 基因敲除小鼠的腹腔原代PMNs 上清液中的cfDNA 的浓度显著升高，说明冷暴露促进了NETs 的生成。

由于NETs 是以DNA 为骨架结构上面还黏附着大量的蛋白质，所以只检测cfDNA 的浓度不足以说明问题，因此，研究还检测了NETs 组件蛋白质MPO、CitH3 等的蛋白质表达水平。结果显示，TLR2、TLR4 基因敲除小鼠在受到冷暴露后所提取的腹腔原代PMNs 的蛋白质中MPO、CitH3 的表达水平与常温对照组比均有显著升高。进一步说明了在TLR2、TLR4 基因的敲除不影响冷暴露诱导NETs 的形成增加；有研究显示，冷暴露作为内源性因素可引起机体代谢变化，而导致H3 的瓜氨酸化的修饰，而组蛋白的这一修饰方式也是NETs 产生的主要原因之一[23-25]。

4 结论

综上所述发现，敲除TLR2 和TLR4 基因的小鼠在受到冷暴露后，提取的腹腔原代PMNs 仍可生成NETs，说明冷暴露能够诱导TLR2 和TLR4 基因敲除小鼠腹腔原代中性粒细胞形成NETs。