尼古丁依赖男大学生运动习惯与认知功能的关联研究：基于肠道菌群和非靶向代谢的联合组学分析

董玮仲，宋 刚，罗 炯，廖帅雄，杜然浩，苗伟杰，张华明，赖明航

（1.西南大学 体育学院，重庆 400715；2.浙江大学 体育系，浙江 杭州 310058；3.内蒙古科技大学 体育教学部，内蒙古 包头 014010）

我国吸烟人口数约占全国人口数的25%，男子吸烟率接近 50%（Wang et al.，2019b）。2019年，全球吸烟者的数量达到了11亿的新高，世界上大约每3个吸烟者中就有1个来自中国（GBD 2019 Tobacco Collaborators，2021）。最新研究预测，未来20年中国因吸烟引发的相关癌症导致的死亡人数将增加约50%（Li et al.，2021）。吸烟已经成为我国重要的公共健康问题。吸烟的危害主要来自尼古丁成瘾。成瘾物质导致大脑结构和功能的持久改变（Wang et al.，2019a），引发认知功能损伤（胡鹏娟 等，2018），尤其是降低工作记忆和抑制能力（Fried et al.，2006；Swan et al.，2007）。动物实验也证实尼古丁损害认知功能（周跃辉 等，2016；Leslie，2020）。

运动有助于尼古丁成瘾的戒断（Masiero et al.，2020；Ussher et al.，2019），能有效地抑制吸烟者对香烟的渴求（Van Rensburg et al.，2012）。有研究表明，吸烟状态与轻度认知功能相关（Sonoda et al.，2016），提高认知功能有助于提高戒烟成功率（Evans et al.，2019），而运动能改善认知能力（Landrigan et al.，2020）。大量的研究结果证实，运动对不同年龄段、多种退行性疾病患者的认知功能具有改善作用（Bidzan-Bluma et al.，2018；Carson et al.，2016；Watson et al.，2007；Zeng et al.，2017）。其机制包括：1）运动可以促进不同脑区的脊髓液生成，对突触结构和功能进行保护（Van Dongen et al.，2016）；2）运动与海马体体积增大有关（Erickson et al.，2009）；3）运动训练通过调节小脑和运动皮层影响认知功能（Zhang et al.，2019）；4）运动促进脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BNDF）的分泌，从而改善认知功能（Cassilhas et al.，2016）；5）运动通过肠道菌群-肠-脑轴影响认知功能——运动可以增加体内有益菌种的丰度（双歧杆菌等），提高肠道菌群多样性（Zhong et al.，2021），肠道菌群及其产生的肠道代谢物含有大量神经递质（短链脂肪酸等），这些代谢物参与维持大脑功能的调节（宋刚等，2019；Alam et al.，2014；Dalile et al.，2019）。

研究表明，吸烟也可改变肠道菌群组成（Capurso et al.，2017；Wang et al.，2019c）。吸烟会导致吸烟者的拟杆菌门增加，厚壁菌门和变形杆菌门减少（Huang et al.，2019），同时吸烟会导致肠道菌群多样性的减少（Savin et al.，2018）。动物实验也证实，小鼠肠道菌群的Christensenellaceae、Mogibacteriaceae等菌种受到尼古丁的影响（Chi et al.，2017）。最近，刊发的Fluhr等（2021）的研究发现，暴露于烟草烟雾3周后小鼠肠道菌群出现改变，戒烟后仍不能恢复正常。

来自于动物和人类的研究都已证实，运动对尼古丁依赖个体的认知功能有积极影响；同时，越来越多的证据表明，肠道菌群的变化会影响认知功能（Cryan et al.，2012；Mohajeri et al.，2018；Sharon et al.，2016）。但从肠道菌群-肠-脑轴的角度对运动改善尼古丁依赖者认知功能的报道鲜见。据此我们推测，运动诱导肠道菌群及其代谢物的改变可以改善尼古丁依赖大学生的认知功能。本研究为将来以肠道菌群及其代谢物为靶点改善尼古丁依赖者认知功能提供证据。

1 研究对象与研究方法

1.1 研究对象

在西南大学校内招募200名男性吸烟大学生，发放尼古丁依赖检验量表（The Fagerstrom Test of Nicotine Dependence，FTND）和国际体力活动量表（International Physical Activity Questionaire），结合纳入和排除标准，筛选出有运动习惯尼古丁依赖男大学生（HE组）和无运动习惯尼古丁依赖男大学生（n-HE组）各15人。纳入和排除标准：1）每天吸烟数量在5根及以上；2）近期没有服用抗生素；3）通过FTND测评达到尼古丁依赖中度及以上水平；4）本人及直系亲属没有医疗和精神疾病；5）没有尼古丁之外的药物滥用或依赖障碍；6）身体健康，没有躯体残疾或医疗问题而影响行为学测试；7）近一周无腹泻等肠胃道症状。有任何一条不满足者排除出正式实验。

如表1所示，两组被试除了身体活动量外其他人口学变量没有显著性差异。本研究获得西南大学体育学院伦理委员会审批（SWU-TY20200701），所有被试在实验前均已签署知情同意书。

表1 本研究被试基本情况Table 1 Basic Information of the Subjects

1.2 实验设计

正式实验前一周完成被试的筛选并通知被试实验时间。被试来到实验室后告知被试整体实验流程，对可能的问题进行说明讲解，同时签署知情同意书。随后进行认知能力测试。为了避免测试顺序对实验结果造成的影响，一半被试先进行工作记忆测试，另一半被试先进行抑制能力的测试。在测试完成后收集肠道菌群分析和宿主代谢分析所需要的粪便样本。

1.3 数据收集

1.3.1 认知能力

工作记忆能力测试选取改编版的斯腾伯格范式（周跃辉，2016；图1A）。如果探测数字是编码刺激中出现过的，则要求被试按“F”键反应；相反，如果探测数字没有在编码刺激中出现过，则要求被试按“J”键反应。在整个实验过程中，要求被试尽可能迅速地正确按键反应，记录其反应时与正确率。正式实验包括60个试次，其中编码刺激1位数字、3位数字和5位数字出现的数量各占1/3，出现的顺序随机。

图1 认知测试任务示意图Figure 1.Schematic Diagram of Cognitive Test Tasks

抑制能力测试任务选取标准的Go/NoGo范式（图1B），实验刺激由X和Y两个字母组成，其中X和Y呈现的顺序随机。当电脑屏幕呈现出的字母为X时，则为Go试次，要求被试按“0”键反应；当电脑屏幕呈现出的字母为Y时，则为NoGo试次，要求被试抑制自己的按键操作。被试需要完成1个组块，共120个试次，其中Go试次和No-Go试次的比率为4∶1（96个Go试次，24个NoGo试次）。

1.3.2 肠道菌群

样品采集和DNA提取：粪便样品在某大学校医院采集，采样后3 h内于-80℃冰箱冷冻。使用QIAamp快速DNA粪便迷你试剂盒（美国加利福尼亚州Qiagen）进行DNA提取。使用纳米滴管2 000（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆热科学公司）测量细菌DNA的浓度。

高通量测序：细菌群落通过IlluminaMiSeq高通量测序进行研究。选择16S rDNA基因的V3和V4区域进行聚合酶链式反应。引物被条形码标记为338 F（5’-ACTCCTAGGGAGCAGCAG-3’）和806 R（5’-GGACATCHVGGGTWTTCTAAT-3’），其中条形码是每个样品特有的8碱基序列。20µL聚合酶链式反应混合物由4µL 5×FastPFU缓冲液、2µL 2.5 mmol/L脱氧核糖核酸、5µmol/L正向和反向引物、0.4µL TransStartFastpfu DNA聚合酶（转基因生物技术公司，北京）和10µg DNA模板组成。进行以下循环参数：保持在95℃2 min，27个循环（95℃30 s、55℃30 s和72℃30 s），最后在72℃延伸5 min。每个样品收集3份反应混合物，用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒（美国加利福尼亚州联合城Axygen）纯化，用定量荧光-ST荧光定量系统（美国威斯康星州麦迪逊市Promega）定量。来自不同样品的扩增子被发送到深圳微生态科技有限公司的IlluminaMiSeq平台上进行测序。

测序数据的处理：使用QIIME（1.9.1）按照Song等（2017）提到的3个标准对原始fastq文件进行解复用和质量过滤。使用UPARSE（7.12）以97%的相似性截止值对操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs）进行聚类，并使用UCHIME识别和去除嵌合序列。每个16S rRNA基因序列的分类用RDP分类器对照Silva（SSU128）16S rRNA数据库通过使用70%的置信阈值进行分析。肠道菌群的有关数据已经上传至中国科学院上海营养与健康研究所国家组学数据百科全书（National Omics Data Encyclopedia，NODE）数据库（Sample ID：OEX012780）。

1.3.3 肠道代谢物

代谢物的提取：精确称量样本100 mg（±1%）于2 mL的EP管中，准确加入0.6 mL 2-氯苯丙氨酸（4 ppm）甲醇（-20℃）配制，涡旋振荡30 s后加入100 mg玻璃珠，放入组织研磨器中，50 Hz研磨90 s；再进行室温超声10 min；随后12 000 rpm 4℃离心 10 min，取上清液 300 μL过0.22 μm膜过滤，过滤液加入到检测瓶中；自每个待测样本各取20µL混合成QC样本，用剩余待测样本进行色谱-质谱（LC-MS）检测（Wang et al.，2020）。

基于LC-MS的代谢物检测：色谱条件仪器采用Thermo Ultimate 3000，使 用 ACQUITY UPLCHSS T3 1.8 µm（2.1×150 mm）色谱柱，自动进样器温度设为8℃，以0.25 mL/min的流速，40℃的柱温，进样2 μL进行梯度洗脱，流动相为正离子0.1%甲酸水（C）-0.1%甲酸乙腈（D）；负离子5 mmol/L甲酸铵水（A）-乙腈（B）。梯度洗脱程序为0～1 min，2% B/D；1～9 min，2%～50% B/D；9～12 min，50%～98%B/D；12～13.5 min，98%B/D；13.5～14 min，98%～2% B/D；14～20 min，2%D正模式（14～17 min，2% B-负模式）。质谱条件仪器使用Thermo Q Exactive Plus，电喷雾离子源（ESI），正负离子电离模式，正离子喷雾电压为4.20 kV，负离子喷雾电压为3.50 kV，鞘气30 arb，辅助气10 arb。毛细管温度325℃，以分辨率70 000进行全扫描，扫描范围81～1 000，并采用HCD进行二级裂解，碰撞电压为30 eV，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息（Ponnusamy et al.，2011；Want et al.，2010）。

代谢物的鉴定：代谢物的鉴定首先根据精确分子量进行确认（分子量误差为＜=30 ppm），后续根据MS/MS碎片模式对Human Metabolome Database（HMDB）、METLIN、Massbank、LipidMaps、mzClound等数据库确认注释获得代谢物（Smith et al.，2006）。

1.4 统计分析

考虑到肠道菌群的数据采用非参数检验，为了保证统计分析的一致性，认知功能的组间差异采用曼-惠特尼U（Mann-Whitney U）检验检验；肠道菌群α多样性使用mothur软件进行指数分析，组间差异采用Wilcoxon秩和检验。组间差异分析采用线性判别分析（Linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）。代谢组学的分析中，使用偏最小二乘判别分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA）对不同组别尼古丁成瘾大学生的代谢物进行分析，最后进行富集分析（Enrichment Analysis），通过过代表分析（over representation analysis，ORA）方法判断代谢物在代谢通路中的富集程度，随后使用拓扑分析（topology analysis）进一步明确代谢通路的重要性，并与京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库比较确定可能影响的代谢通路。采用斯皮尔曼相关分析（Spearman’s correlation analysis）对认知功能、肠道菌群和非靶向代谢组学结果进行相关性分析。本研究中P＜0.05为有显著性差异；P＜0.01为有非常显著性差异。

2 结果

2.1 认知功能差异分析

2.1.1 工作记忆

Mann-Whitney U检验结果显示（图2），在较为简单的1位数字任务中，不同运动习惯的被试反应时和正确率没有显著性差异（反应时：Z=-1.265，P=0.217；正确率Z=-0.565，P=0.624）；而在难度较高的3位数字任务和5位数字任务中，HE组反应时显著快于n-HE组（3位数字任务：Z=-2.592，P=0.009＜0.01；5位数字任务：Z=-2.800，P=0.004＜0.01），正确率HE组也显著高于n-HE组（3位数字任务：Z=-2.950，P=0.003＜0.01；5位数字任务：Z=-3.217，P=0.001＜0.01）。研究结果表明，HE组被试数字记忆识别能力显著好于n-HE组，尤其是在难度较高的数字记忆识别中。

图2 不同任务类型尼古丁依赖男大学生的反应时和正确率Figure 2.Response Time and Accurary of Male College Students with Nicotine Dependence of Different Task Types

2.1.2 抑制能力

在测试抑制功能的Go/NoGo任务中，不同运动习惯的大学生在反应时和正确率上也有区别（图3）：在Go任务上，两组被试的正确率没有显著性差异（Z=-1.763，P=0.098），但 HE组反应时显著低于 n-HE组（Z=-2.219，P=0.026＜0.05）；在NoGo任务中，HE组被试正确率显著高于n-HE组（Z=-1.982，P=0.050）。结果表明，HE组被试的抑制功能好于n-HE组被试。

图3 Go/NoGo任务尼古丁依赖男大学生的反应时和正确率Figure 3.Response Time and Accuracy of Male College Students with Nicotine Dependence in Go/NoGoTask

2.2 肠道菌群差异分析

对不同运动习惯尼古丁依赖大学生的肠道菌群多样性进行α多样性分析，采取Faith-pd指数和Shannon指数进行研究，结果如图4所示，各多样性指数在组间并没有显著性差异。

图4 不同运动习惯尼古丁依赖男大学生肠道微生物α多样性指数检验Figure 4. α Diversity Index Test of Gut Microbiota with Different Exercise Habits Nicotine Dependent Male College Students

此外，如图5所示，HE组和n-HE组之间的样本没有形成明显的聚类，主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）的区分度不明显，不能将两组肠道菌群按群落组成划分为不同的类群，表明HE组和n-HE组被试肠道菌群OTU组成结构相似，差异程度较小。

图5 不同组别尼古丁依赖男大学生肠道菌群OTU水平的主坐标分析Figure 5.Principal Coordinate Analysis of OTU Level of Gut Microbiota in Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

LEfSe多级物种差异判别分析结果显示，HE组和n-HE组在各分类水平上均存在显著差异的物种，差异结果如图6所示。n-HE组丰度显著高于HE组的有埃希氏菌属（Escherichia，P=0.002），在HE组丰度显著高的肠道菌群中，纲水平（class）上有β-变形菌纲（Betaproteobacteria，P=0.005）和丹毒丝菌纲（Erysipelotrichia，P=0.026），在目层级（order）上有伯克氏菌目（Burkholderiales，P=0.005）和丹毒丝菌目（Erysipelotrichales，P=0.026），科水平（family）上有产碱杆菌科（Alcaligenaceae，P=0.006）、克里斯滕森菌科（Christensenellaceae，P=0.035）和丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae，P=0.026），属水平（genus）上有萨特氏菌属（Sutterella，P=0.005）和克里斯滕森氏菌属（Christensenella，P=0.035）。

图6 不同组别尼古丁依赖大学生肠道菌群LEfSe分析Figure 6.LEfSe Analysis of Gut Microbiota in Different Groups of Nicotine Dependent College Students

2.3 代谢物差异分析

2.3.1 代谢物含量统计

将所有代谢物用KEGG数据库br08001进行注释，得到代谢物的生物学作用，然后统计每个代谢物的百分比含量，绘制百分比含量堆积柱形图。如图7所示，纵坐标表示各个代谢物的百分比含量，可以看出，肽类（peptides）作用的代谢物含量最高，其次是脂类（lipids）。

图7 不同组别尼古丁依赖男大学生肠道具有生物学作用的代谢物百分比堆积Figure 7.Column Chart of Metabolite Percentage Accumulation with Biological Effects in Gut Tract of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

聚类结果如图8所示，可以看出，HE组和n-HE组被试的样本在不同代谢物上的含量不同，其中与认知功能有关的代谢物γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）和乙酰胆碱（acetylcholine）在HE组的含量显著高于n-HE组，肌氨酸（creatin）和鞘氨醇（sphingosine）含量HE组显著低于n-HE组。

图8 不同组别尼古丁依赖男大学生肠道代谢物聚类结果Figure 8.Heatmap of Gut Metabolites of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

2.3.2 特征代谢物的筛选

使用PLS-DA对不同组别代谢物进行分析，结果如图9所示，在标记出的36种重点关注的代谢物中，与认知功能有关的包括丙酮酸（pyruvic acid）、米非司酮（mifepristone）、芥子酸（sinapic acid）和鞘氨酸（sphinganine）等。

图9 不同组别尼古丁依赖男大学生肠道代谢物PLS-DA结果Figure 9.PLS-DA results of Gut Metabolites of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

2.3.3 代谢物通路分析

通过富集分析探究差异代谢物结果如图10A所示，其横坐标富集倍数=观测代谢物数/理论代谢物数。图10B中蓝色区域的代谢通路是拓扑分析中有显著差异的代谢通路，可以看到，2组被试间代谢物通路有显著差异的是精氨酸和脯氨酸代谢（arginine and proline metabolism）、赖氨酸降解（lysine degradation）和戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway）。

图10 不同组别尼古丁依赖男大学生肠道代谢物ORA富集分析和拓扑分析Figure 10.EnrichmentAnalysis and TopologicalAnalysis of Metabolite ORAof Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

2.4 认知功能与肠道菌群及肠道代谢物的相关性

2.4.1 认知功能与肠道菌群的相关性

选取不同运动习惯大学生存在差异的认知结果与其肠道微生物在科水平上的丰度进行相关性分析，结果如图11所示。可以看出，认知功能与酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）和变形菌门（Proteobacteria）有关。与工作记忆准确性（N3_ACC、N5_ACC）呈显著正相关的细菌有产碱杆菌科（Alcaligenaceae，P＜0.01），呈显著负相关的有噬几丁质菌科（Chitinophagaceae，P＜0.05）和普雷沃氏菌科（Prevotellaceae，P＜0.05）；与工作记忆反应时（N3_RT、N5_RT）呈显著负相关的有拟杆菌科（Bacteroidaceae，P＜0.05）、产碱杆菌科（Alcaligenaceae，P＜0.05）、孪生菌科（Gemellaceae，P＜0.05）、巴斯德氏菌科（Pasteurellaceae，P＜0.05）、黄色单胞菌科（Xanthomonadaceae，P＜0.05）和臭杆菌科（Odoribacteraceae，P＜0.05）等；与抑制能力反应时呈显著正相关的有mb2424菌科（P＜0.05），呈显著负相关的则有柄杆菌科（Caulobacteraceae，P＜0.05）等。

图11 不同运动习惯尼古丁依赖男大学生认知能力与肠道菌群相关性Figure 11.Correlation between Cognitive Function and Gut Microbiota of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

2.4.2 认知功能与肠道代谢物的相关性

从图12可以看出，吡哌酸（pipecolic acid，P＜0.01）、吲哚（indole，P＜0.05）等代谢物与NoGo任务准确率呈显著正相关，肌氨酸（creatine，P＜0.01）、三乙胺（triethylamine，P＜0.01）与5位数字任务准确率呈显著负相关。在反应时方面，与工作记忆反应时呈显著正相关的有油酸（oleic acid，P＜0.01）、左旋天冬氨酸（L-aspartic acid，P＜0.01）、L-谷氨酰胺（L-glutamine，P＜0.05）、L-丝氨酸（L-serine，P＜0.05）等，呈显著负相关的有京尼平（genipin，P＜0.05）等；与Go任务反应时呈负相关的有石碳酸（phenol，P＜0.01）、4-（乙酰氨）-2-氨基丁酸（4-acetamido-2-aminobutanoic acid，P＜0.05）等，呈正相关的有 1，5-戊二胺（cadaverine，P＜0.01）。

图12 不同运动习惯尼古丁依赖男大学生认知能力与代谢相关性Figure 12.Correlation between CognitionFunction and Metabolism of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

2.4.3 肠道菌群和肠道代谢物的相关性

将个体代谢物与肠道菌群进行相关性分析，结果如图13所示，在与认知有关的代谢物中，米非司酮（mifepristone）与拟杆菌科等呈显著正相关（P＜0.05），与肠杆菌科等呈显著负相关（P＜0.05）；鞘氨酸（sphinganine）与理研菌科和拟杆菌科等呈显著正相关（P＜0.05），与厚壁菌门的Peptostreptococcaceae菌科和Tissierellaceae菌科呈显著负相关（P＜0.05）；丙酮酸（pyruvic acid）与厚壁菌门的Carnobacteriaceae菌科呈显著正相关（P＜0.05），芥子酸（sinapic acid）与厚壁菌门的巴斯德氏菌科、生丝微菌科呈显著正相关（P＜0.05）。

图13 不同运动习惯尼古丁依赖男大学生肠道菌群与代谢物相关性Figure 13.Correlation between Gut Microbiota and Metabolites of Male College Students with Nicotine Dependence in Different Groups

3 讨论

3.1 运动习惯保护和提高尼古丁依赖男大学生的认知功能

吸烟会导致多种系统性疾病，认知功能损伤是常见的临床表现之一。长期吸烟甚至会导致脑结构的损伤。Peng等（2017）发现，吸烟会对大脑体积造成影响，中青年吸烟者大脑的灰质与白质体积均小于正常人。吸烟者大脑减少的灰质区域可能是与认知功能有关的关键区域（胡鹏娟等，2018）；来自脑功能和连接组学的研究数据表明，运动习惯对人的认知功能存在改善作用（Won et al.，2021），且运动作为一种干预手段可以改善药物依赖造成的脑途径损伤（Koob et al.，2010）。一些使用Go/NoGo范式的研究表明，吸烟者在抑制控制方面存在困难（Luijten et al.，2011）；另有大量的研究证实，中等强度的运动显著增强了人体的抑制能力（Akatsuka et al.，2015；Weng et al.，2015）。药物依赖人群的实证研究证明，运动可以重建被药物劫持的食物奖励途径，并恢复对自然奖励的敏感性（Wang et al.，2019a；Zhou et al.，2019）。可见，保持运动习惯是一种改善成瘾者认知损害，保护成瘾者认知功能的方法。

本研究结果显示，HE组被试与n-HE组被试相比，工作记忆反应时更快，且正确率高，提示，运动习惯对尼古丁依赖男大学生工作记忆具有积极的改善作用；同时，抑制能力测试也显示HE组被试在NoGo条件下的正确率显著高于n-HE组被试，表明运动习惯对尼古丁依赖男大学生抑制能力产生积极保护作用。结合尼古丁对认知功能损害的已有文献报道可见，在尼古丁依赖男大学生群体中，运动习惯可以对认知功能，尤其是工作记忆和抑制能力起到保护作用。

3.2 运动习惯改变尼古丁依赖男大学生肠道菌群组成

近年来，肠道菌群被认为是治疗成瘾的潜在靶位点（Skosnik et al.，2016），运动、肠道菌群和成瘾三者之间存在关联（宋刚 等，2019；Biedermann et al.，2014）。横断面研究发现，运动能力较差的高血压老人其体内β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、伯克氏菌目（Burkholderiales）和产碱杆菌科（Alcaligenaceae）等菌群丰度显著低于运动能力较好的高血压老人（Yu et al.，2018）。2020年，Nolan-Kenney等在对孟加拉国尼古丁依赖者的肠道菌群分析中发现，丹毒丝菌纲（Erysipelotrichia）、丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）和丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）在正常人群与吸烟人群中的丰度存在显著性差异。

本研究发现，运动习惯对肠道菌群的改善作用体现在菌种丰度的差异方面，而不是肠道菌群多样性方面。这与目前有关运动丰富肠道菌群多样性（Allen et al.，2018；Dalton et al.，2019）的研究结果不太一致。我们推测是吸烟抵消了运动对肠道菌群多样性带来的积极影响。当然，这一现象的成因还需要进一步的探究。本研究中HE组的β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、伯克氏菌目（Burkholderiales）和产碱杆菌科（Alcaligenaceae）的丰度高于n-HE组；同时还发现，n-HE组的埃希氏菌属（Escherichia）丰度显著高于HE组。埃希氏菌属被发现与人体肠道三甲胺和炎症的发生有关，是一种有害菌（Rath et al.，2017），另有研究发现这种细菌的丰度在运动能力降低的患者中会有所增加（Yu et al.，2018）。据此推测，n-HE组被试肠道菌群里的有害微生物丰度升高，可能对健康造成负面影响。此外，在本研究中发现，HE组被试的丹毒丝菌纲（Erysipelotrichia）、丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）和丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）丰度高于n-HE组，可知这些菌种的丰度也受到运动习惯的影响。综上认为，尼古丁依赖男大学生体内肠道菌群的丰度受到运动习惯的调节，运动提高了肠道菌群中有益菌的丰度，降低了有害菌的丰度，从而产生健康效益。

3.3 运动习惯改变尼古丁依赖男大学生肠道代谢物

运动会改变体内代谢物的含量。马拉松运动员血液代谢组学研究发现，丙酮酸（pyruvic acid）在参加马拉松比赛后含量显著增加（Shi et al.，2020）。众所周知，丙酮酸是运动供能体系中的重要物质，它在三大营养物质的代谢途径中起着重要的枢纽作用（干懿洁等，2006；王翔等，2002）。人体研究发现，运动可以提高丘脑中γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）水平（Streeter et al.，2010）。而在动物模型中发现，长期运动可以通过提高GABA丰度缓解大鼠认知功能损伤（Lin et al.，2019）。血液代谢组学的研究结果证实，运动时精氨酸和脯氨酸代谢以及戊糖磷酸途径2条代谢通路参与肌肉线粒体功能调节以及加强蛋白质稳态平衡能力（Shen et al.，2021；Shimada et al.，2021）。代谢组学结果揭示了众多代谢物和代谢通路会参与运动促进健康。

本研究利用基于液质联用（LC-MS）非靶向代谢组学对肠道代谢物进行分析检测发现，GABA、鞘氨醇（sphingosine）等代谢物组间存在显著性差异，对肠道代谢物进行PLS-DA分析结果表明，丙酮酸、米非司酮（mifepristone）、芥子酸（sinapic acid）和鞘氨酸（sphinganine）等代谢物可以作为区分不同运动习惯尼古丁依赖大学生的特征代谢物，ORA富集分析结果提示，在代谢通路方面，精氨酸和脯氨酸代谢以及戊糖磷酸途径存在组间差异。这些结果与以往其他代谢组学的研究一致，即运动习惯会对尼古丁依赖大学生的肠道菌群代谢物产生影响，但改变的代谢物存在差异。需要指出来的是，运动习惯改变肠道代谢物的机制尚不明确，亟待进一步研究。

3.4 尼古丁依赖男大学生肠道菌群及肠道代谢物与其认知功能存在相关

肠道菌群与肠道代谢物一起参与对认知的调节，其通路是肠道菌群-肠-脑轴（Margolis et al.，2021），肠道菌群是认知功能重要的生物标志物（Morais et al.，2021），不同菌种对于认知功能的影响不同厚壁菌门与拟杆菌门间的比值被认为可以用来区分老年痴呆症患者和正常老年人（Ticinesi et al.，2019）；普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）是产生丁酸的主要细菌，其丰度被证实与阿尔兹海默症患者认知功能有关（Tran et al.，2019）；拟杆菌科（Bacteroidaceae）与认知功能存在关联，动物实验证实，在认知障碍小鼠中肠道菌群拟杆菌科丰度显著低于正常小鼠（Luo et al.，2020），但其背后的机制仍不清楚。本研究发现，厚壁菌门的孪生菌科（Gemellaceae）和未分类的梭菌科（Unspecified_Clostridiales）与工作记忆和抑制能力反应时呈显著负相关，拟杆菌门的普雷沃氏菌科与准确率呈显著负相关，拟杆菌科与工作记忆反应时呈显著负相关。这些结果印证了前人有关肠道菌群与认知能力的相关研究，表明个体内普雷沃氏菌科、拟杆菌科等菌种丰度与认知能力的负向相关关系。

肠道菌群代谢物也可能会影响个体的认知能力。5-羟色胺（5-HT）是吲哚（indole，肠道菌群代谢物之一）的衍生物，在体内参与认知功能的调节。5-HT水平下降可能会加剧认知衰退（Jenkins et al.，2016），动物实验证实，5-HT水平的上调与认知功能的恢复紧密相关（Zhang et al.，2020）。研究表明，京尼平被证实可以改善小鼠的记忆能力（Nam et al.，2013）；石碳酸（phenol）中的丁苯酚在改善血管性痴呆症患者的认知功能中被广泛应用（郭达云，2017）；L-谷氨酰胺（L-glutamin）丰度与γ-氨基丁酸（GABA）的水平呈正相关，而GABA在前人的研究中被证实会影响认知功能（Wang et al.，2007）；此外，L-丝氨酸（L-serine）可以保护认知功能，有研究发现补充L-丝氨酸对阿尔兹海默症小鼠的认知缺陷起到预防作用（Le Douce et al.，2020）。也就是说，这些肠道代谢物的丰度会对认知能力造成影响。本研究再次验证了这些代谢物与认知功能的关系：吲哚、京尼平和石碳酸丰度与认知能力呈正相关。此外，本研究还发现，L-谷氨酰胺和L-丝氨酸与工作记忆反应时呈正相关，意味着其丰度越高，工作记忆水平越差，这与前人的研究结果不一致，其原因还需要进一步探究。本研究对肠道菌群与代谢物进行的相关分析发现，拟杆菌科丰度与米非司酮丰度呈显著正相关，巴斯德氏菌科（Pasteurellaceae）丰度与芥子酸丰度呈显著正相关。提示，肠道菌群拟杆菌科、巴斯德氏菌科可能通过代谢物米非司酮、芥子酸影响认知功能。Yalin等（2021）在一项针对健康男子视觉空间学习和工作记忆的神经相关性研究中发现，米非司酮可以增强人类视觉空间记忆的效率，对认知功能有积极促进作用。Verma等（2020）研究表明，芥子酸对药物诱导的认知障碍大鼠具有一定的神经保护作用，提示其可以改善阿尔兹海默症等认知功能障碍患者的学习记忆能力。结合现有研究来看，米非司酮、芥子酸等物质会受到肠道菌群调控，并对认知功能产生正向影响。上述相关性结果有助于从肠道菌群-肠-脑轴视角下理解运动改善尼古丁依赖者认知功能的机制，从而进一步明确尼古丁依赖人群中，运动对认知功能起保护作用的可能路径。

本研究还存在以下不足：首先，本研究考察了不同运动习惯尼古丁依赖男性大学生的认知能力、肠道菌群和代谢物的差异，并对三者进行相关分析，以揭示肠道菌群和代谢物对认知功能的影响，但是横断面研究并不能揭示因果关系；其次，虽然在选取被试时考虑了个体肠道菌群的差异性，并尽可能通过纳入和排除标准进行筛选，但是依然不能避免未知的影响肠道菌群的混杂因素。未来的研究可以通过设计纵向干预的随机对照实验，同时采用无菌动物作为研究对象，探明肠道菌群及肠道代谢物在运动改善尼古丁依赖者认知功能中的中介作用，进一步丰富肠道菌群-肠-脑轴相关理论。

4 结论

运动习惯改善尼古丁成瘾者的认知功能，不同运动习惯尼古丁依赖者肠道菌群和肠道代谢物存在差异，而肠道菌群及肠道代谢物与认知功能密切相关。提示，肠道菌群及肠道代谢物参与运动习惯对尼古丁成瘾者认知功能的保护，是改善尼古丁成瘾者认知功能的潜在治疗途径。