银杏肽对高脂膳食诱导的高脂血症小鼠的降脂作用

郑 义，李诗颖，李 闯，梁一凡，糜心怡，陈 琳

（1.徐州工程学院食品与生物工程学院，江苏徐州 221018；2.江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏徐州 221018）

高脂膳食是高脂血症的重要诱因，而高脂血症，尤其是高胆固醇血症，是动脉粥样硬化和冠心病等心血管疾病最常见的危险因素之一。近年来，营养和健康日益受到重视，我国居民膳食营养状况总体得到改善，膳食因素对心血管疾病死亡率的归因比例有所下降，但膳食结构不合理的状况仍在延续，目前心血管病仍是我国居民首位死亡原因[1]；心血管病危险因素的流行水平较为严峻，需进一步加强心血管病的防治工作[2]。大剂量长期服用他汀类降脂药会导致高血糖、肝酶升高、神经损伤、肌肉疼痛等副作用。研究表明来源于橄榄、大豆、糙米、燕麦、荞麦、花生、淡水哈、卵形鲳鲹鱼、沙丁鱼等动植物蛋白的生物活性肽具有较好的辅助降血脂作用[3]。

银杏肽为银杏蛋白经过单酶或复酶水解后分离所得的低聚肽，已被证实具有抗氧化、降血糖和肝保护等作用。张焕新等[4]研究表明银杏肽对邻苯三酚自氧化和亚油酸氧化具有较强的抑制活性，对超氧阴离子和羟基自由基具有较好的清除活性。贾韶千等[5-6]制备得到了相对分子量为452.21 的银杏肽，在质量浓度为1.0 mg/mL 时，该肽对DPPH 和羟基自由基的清除率均在80%以上。Ma 等[7]纯化和鉴定了3 种相对分子质量小于1000 的ACE 抑制肽，分子对接结果表明银杏肽主要通过氨基酸残基与ACE 活性位点结合而抑制ACE 活性。Sun 等[8]纯化得到了相对分子质量小于10000 且具有较好α-葡萄糖苷酶抑制活性的银杏肽，在此基础之上开发了银杏肽功能饮料。郑义等[9]通过急性酒精性肝损伤小鼠模型考察了银杏肽的保肝作用，结果表明银杏肽能降低酒精性肝损伤小鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）水平，抑制促炎细胞因子表达水平，提高肝脏抗氧化酶活性，降低肝脏丙二醛（malondialdehyde，MDA）和蛋白质羰基水平。银杏肽能降低小鼠血清TG 和TC 水平，提示银杏肽具有潜在的降脂作用，有关银杏肽降脂作用的研究未见报道。

本研究采用高脂膳食诱导的高脂血症小鼠模型，基于血脂和炎性因子水平、脂肪消化率、动脉粥样硬化和冠心病等并发症的发病风险、氧化应激状态等方面，评价银杏肽对高脂血症小鼠的降脂作用，旨在为银杏肽的开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜银杏 江苏省邳州市；ICR 小鼠（20±2 g）生产许可证号SCXY （鲁） 20190003，济南朋悦实验动物繁育有限公司；基础饲料和高脂饲料：基础饲料中蛋白、脂肪和碳水化合物的供能比分别为20.54%、12.79%和66.67%；高脂饲料中蛋白、脂肪和碳水化合物的供能比分别为19.54%、47.18%和33.29%江苏省协同生物医药生物工程有限公司；风味蛋白酶（1.5×104U/g） 丹麦诺维信公司；TG、TC、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、MDA 试剂盒 南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）试剂盒 美国R&D 公司；辛伐他汀 国药准字H20010053，江苏联环药业股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

BILON92-IID 超声波细胞破碎仪 上海比朗仪器有限公司；Labscale 小型切向流超滤系统 美国Millipore 公司；723C 可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；LGJ-18A 冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；TGL-16G 型台式离心机 上海安亭科学仪器厂；Synergy2 多功能酶标仪 美国伯腾仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 银杏肽的制备 采用超声辅助碱提酸沉法制备银杏蛋白[10]，考马斯亮蓝法测得纯度为83.42%。按液料比15:1 mL/g 将银杏蛋白与去离子水配成悬液，沸水浴10 min 灭内源性酶；调pH7.7，加入1.2%风味蛋白酶，55 ℃振荡酶解3 h；酶解后沸水浴10 min 灭酶，8000 r/min 离心20 min；将上清液通过截留相对分子质量为1 kDa 的超滤膜，收集滤液，冷冻干燥，得银杏肽，高效凝胶排阻色谱法测得银杏肽相对分子质量分布范围为300～1000。

1.2.2 动物分组与处理 动物实验研究遵循相关国家标准，符合本院实验动物伦理委员会所制定的伦理学标准，得到该委员会批准。60 只ICR 小鼠经适应性饲养后，10 只正常组小鼠饲喂基础饲料，其余50 只小鼠饲喂高脂饲料，连续6 周。造模后，高脂血症小鼠按体质量随机分为5 组：高脂模型组、阳性对照组和三组银杏肽组。低、中和高剂量银杏肽组每天分别灌胃100、200 和400 mg/kg 银杏肽，连续4 周。阳性对照组每天灌胃10 mg/kg 辛伐他汀；正常组和高脂模型组每天灌胃等量去离子水。灌胃期间，各组小鼠自由饮水和摄食基础饲料。每周记录小鼠体质量和摄食量。

1.2.3 小鼠肝脏指数的测定 脂肪表观消化率测定后，颈椎脱臼法处死小鼠，称量小鼠体重。无菌摘取肝脏，称量小鼠肝脏质量，根据肝脏质量与体质量比，计算肝脏指数。

1.2.4 脂肪表观消化率的测定 参考田许等[11]报道的方法测定各组小鼠脂肪表观消化率。末次灌胃24 h后，将小鼠置于代谢笼中，经3 d 适应性饲喂后，收集每只小鼠72 h 内的粪便。称取1 g 小鼠粪便（或饲料），60 ℃烘干至恒重，记录质量。将烘干后的小鼠粪便（或饲料）置于索氏提取器中，采用石油醚抽提6 h，将抽提后的残渣烘干至恒重，记录质量。两次恒重时的质量差即为小鼠粪便（或饲料）中粗脂肪质量。脂肪表观消化率计算公式如下：

1.2.5 血清生化指标的测定 小鼠眼眶后静脉丛采血，室温静置1 h，3500 r/min 离心10 min，收集上清液即为血清，按照试剂盒说明书测定TG、TC、LDLC、HDL-C、IL-6 和TNF-α水平。采用Ghoneim 等[12]报道的方法，计算动脉粥样硬化指数（atherogenic index，AI）和冠心指数（coronary heart index，CHI）。

1.2.6 肝脏抗氧化能力的测定 称取1 g 小鼠肝脏，置于组织匀浆器中，加入9 倍体积生理盐水，制成10%（m/V）肝组织匀浆，3000 r/min 离心10 min，收集上清液，按照试剂盒说明书测定T-AOC、T-SOD和MDA 水平。

1.3 数据处理

采用SPSS 24.0 软件进行数据统计与分析，结果以平均值±标准差表示，组间比较采用Dunnett-t 检验。

2 结果与分析

2.1 对小鼠体质量和肝脏指数的影响

高脂膳食通常会导致肥胖，体质量超过标准值的20%，可定义为肥胖[13]。图1 为银杏肽对高脂血症小鼠体质量和肝脏指数的影响。造模后，高脂模型组小鼠体质量显著高于正常组（P＜0.05），模型组小鼠的体质量比正常组高出26.8%，表明饲喂高脂饲料造成了小鼠肥胖。中、高剂量银杏肽组小鼠体质量显著（P＜0.05）低于模型组，提示银杏肽干预降低了高脂血症小鼠体质量。

图1 银杏肽对高脂血症小鼠体质量和肝脏指数的影响Fig.1 Effects of Ginkgo biloba peptides on the body weight and liver index in hyperlipidemia mice

高脂模型组小鼠的肝脏指数为正常组的1.33倍，肝脏指数显著高于正常组（P＜0.05），提示高脂膳食造成了脂肪在肝脏的堆积，导致肝脏肿大。与高脂模型组相比，低、中、高剂量银杏肽组小鼠肝脏指数均显著下降（P＜0.05），提示银杏肽干预缓解了高脂膳食导致的小鼠肝脏肿大，但低、中、高剂量组间差异不显著（P＞0.05）。阳性对照辛伐他汀也能显著降低小鼠肝脏指数（P＜0.05），但对体质量无显著影响（P＞0.05）。高剂量银杏肽组小鼠肝脏指数与阳性对照组间无显著差异（P＞0.05）。

2.2 对小鼠摄食量和脂肪表观消化率的影响

摄食量可反映小鼠的食欲情况；脂肪表观消化率为脂肪被小鼠摄入前的含量和在粪便中含量的差值，可反映小鼠对脂肪的消化能力。图2 为银杏肽对高脂血症小鼠摄食量和脂肪表观消化率的影响。模型组小鼠摄食量显著高于正常组（P＜0.05），提示高脂膳食提高了小鼠的食欲。低、中、高剂量银杏肽组小鼠的摄食量与高脂模型组无统计学差异（P＞0.05），表明银杏肽对小鼠食欲无显著影响。模型组小鼠脂肪表观消化率显著低于正常组（P＜0.05），表明高脂膳食中脂肪含量过高，超出了小鼠的消化能力。中、高剂量银杏肽组小鼠脂肪表观消化率分别比高脂模型组提高9.37%、13.21%，均显著高于高脂模型组（P＜0.05）。阳性对照辛伐他汀也显著提高了高脂血症小鼠对脂肪的消化能力（P＜0.05）。中、高剂量银杏肽组小鼠摄食量和脂肪表观消化率与阳性对照组间无显著差异（P＞0.05）。

2.3 对小鼠血清TG 和TC 水平的影响

血清TG 和TC 是重要的血脂常规测定指标。图3 为银杏肽对高脂血症小鼠血清TG 和TC 水平的影响。高脂模型组小鼠血清TG 和TC 水平分别是正常小鼠的1.9 和1.7 倍，显著高于正常组（P＜0.05）。与高脂模型组相比，低、中、高剂量银杏肽组小鼠TG 水平分别降低了12.38%、28.22%、43.56%，TC水平分别降低了15.67%、26.49%、40.67%，银杏肽组小鼠血清TG 和TC 水平均显著低于模型组（P＜0.05），高剂量银杏肽组小鼠血清TG 和TC 水平与正常组无显著性差异（P＞0.05），表明银杏肽干预改善了高脂血症小鼠的血脂水平。与高脂模型组相比，辛伐他汀也能显著降低小鼠血清TG 和TC 水平（P＜0.05）。高剂量银杏肽组小鼠TG 和TC 水平与阳性对照组间无显著差异（P＞0.05）。

图3 银杏肽对高脂血症小鼠血清TG 和TC 水平的影响Fig.3 Effects of Ginkgo biloba peptides on the serum TG and TC levels in hyperlipidemia mice

2.4 对小鼠血清LDL-C 和HDL-C 水平的影响

LDL-C 可将胆固醇运输至肝外组织，LDL-C 水平与心血管疾病的发病率及病变程度正相关；HDLC 可将胆固醇从肝外组织转运到肝脏进行代谢，HDL-C 水平与心血管病的患病风险负相关。银杏肽对高脂血症小鼠血清LDL-C 和HDL-C 水平的影响见图4。高脂模型组小鼠血清LDL-C 水平是正常组的2.7 倍，显著高于正常组（P＜0.05）；HDL-C 水平比正常组降低了40.4%，显著低于正常组（P＜0.05）。与模型组相比，银杏肽组小鼠血清LDL-C 水平显著降低，HDL-C 水平显著升高（P＜0.05）；高剂量银杏肽组小鼠血清HDL-C 可恢复至正常水平（P＞0.05）。与模型组相比，辛伐他汀也能显著降低小鼠血清LDLC，升高HDL-C 水平（P＜0.05）。高剂量银杏肽组小鼠LDL-C 水平显著高于阳性对照组（P＜0.05），HDLC 水平与阳性对照组间无显著差异（P＞0.05）。

图4 银杏肽对高脂血症小鼠血清LDL-C 和HDL-C水平的影响Fig.4 Effects of Ginkgo biloba peptides on the serum LDL-C and HDL-C levels in hyperlipidemia mice

2.5 对小鼠AI 和CHI 的影响

AI 和CHI 可分别反映动脉粥样硬化和冠心病的发病风险。图5 为银杏肽对高脂血症小鼠AI 和CHI 的影响。高脂模型组小鼠AI 和CHI 分别是正常组的29.7 和2.8 倍，显著高于正常组（P＜0.05），表明高脂膳食提高了小鼠动脉粥样硬化和冠心病的发病风险。与高脂模型组相比，低、中、高剂量银杏肽组小鼠AI 分别降低了45.67%、74.04%、94.23%，CHI分别降低了30.84%、50.00%、63.63%，均显著低于模型组，且组间差异显著（P＜0.05），表明银杏肽在一定程度上降低了高脂血症小鼠的动脉粥样硬化和冠心病的发病风险。与高脂模型组相比，辛伐他汀也能显著降低小鼠AI 和CHI（P＜0.05）。高剂量银杏肽组小鼠AI 显著高于阳性对照组（P＜0.05），而CHI 与阳性对照组间无显著差异（P＞0.05）。

图5 银杏肽对高脂血症小鼠AI 和CHI 的影响Fig.5 Effects of Ginkgo biloba peptides on the AI and CHI in hyperlipidemia mice

2.6 对小鼠血清IL-6 和TNF-α 水平的影响

IL-6 和TNF-α在炎性损伤过程中扮演着重要角色。图6 为银杏肽对高脂血症小鼠血清IL-6 和TNF-α水平的影响。高脂模型组小鼠血清IL-6 和TNF-α水平显著高于正常组（P＜0.05），提示高脂膳食导致小鼠发生了炎性损伤。与高脂模型组相比，低、中、高剂量银杏肽组小鼠血清IL-6 水平分别降低了13.29%、21.02%、27.46%，TNF-α水平分别降低了15.12%、30.40%、43.52%，均显著低于模型组（P＜0.05），表明银杏肽可缓解高脂血症小鼠的炎性损伤。与高脂模型组相比，辛伐他汀也能显著降低小鼠血清IL-6 和TNF-α水平（P＜0.05）。高剂量银杏肽组小鼠IL-6 和TNF-α水平与阳性对照组间无显著差异（P＞0.05）。

图6 银杏肽对高脂血症小鼠血清IL-6 和TNF-α水平的影响Fig.6 Effects of Ginkgo biloba peptides on serum IL-6 and TNF-α levels in hyperlipidemia mice

2.7 对小鼠肝脏抗氧化能力的影响

T-AOC 反映机体的总抗氧化能力，T-SOD 在机体氧化与抗氧化平衡中扮演着重要的角色。银杏肽对高脂血症小鼠肝脏T-AOC 和T-SOD 活性的影响如图7 所示。高脂模型组小鼠肝脏T-AOC 和T-SOD活性分别比正常组降低了34.9%和30.7%，均显著低于正常组（P＜0.05），提示高脂膳食致高脂血症小鼠肝脏处于氧化应激状态。灌胃银杏肽后，小鼠肝脏T-AOC 和T-SOD 活性显著高于高脂模型组（P＜0.05），高剂量银杏肽组小鼠T-AOC 和T-SOD 活性恢复至正常水平（P＞0.05），表明银杏肽通过提高机体抗氧化能力，发挥对高脂血症小鼠的保护作用。与高脂模型组相比，辛伐他汀也能显著提高小鼠肝脏T-AOC 和T-SOD 活性（P＜0.05），高剂量银杏肽组小鼠肝脏TAOC 和T-SOD 活性显著高于阳性对照组（P＜0.05）。

图7 银杏肽对高脂血症小鼠肝脏T-AOC 和T-SOD活性的影响Fig.7 Effects of Ginkgo biloba peptides on T-AOC and T-SOD activities of liver tissue in hyperlipidemia mice

MDA 水平升高被认为是机体脂质过氧化的重要标志。银杏肽对高脂血症小鼠肝脏MDA 水平的影响如图8 所示。高脂模型组小鼠肝脏MDA 水平显著高于正常组（P＜0.05），表明高脂膳食摄入造成肝组织脂质氧化损伤。与高脂模型组相比，低、中、高剂量银杏肽组小鼠肝脏MDA 水平分别降低了16.67%、28.07%、40.06%，均显著低于模型组（P＜0.05），提示银杏肽可缓解高脂膳食诱导的肝组织脂质氧化损伤。与高脂模型组相比，辛伐他汀也能显著降低小鼠肝脏MDA 水平（P＜0.05）；高剂量银杏肽组小鼠肝脏MDA 水平显著低于阳性对照组（P＜0.05）。

图8 银杏肽对高脂血症小鼠肝脏MDA 水平的影响Fig.8 Effects of Ginkgo biloba peptides on MDA level of liver tissue in hyperlipidemia mice

3 讨论与结论

高脂膳食是引发高脂血症的常见风险因素之一。高脂膳食诱导的高脂血症动物模型被广泛用于评价受试物的辅助降血脂功能。本试验中，连续6 周饲喂高脂饲料造成了小鼠肥胖，肝脏指数显著升高，脂肪表观消化率显著下降（P＜0.05）；血清TG、TC、LDL-C、IL-6 和TNF-α水平显著升高，HDL-C水平显著下降（P＜0.05）；肝脏T-AOC 和T-SOD 活性显著降低，MDA 水平显著升高（P＜0.05）；小鼠动脉粥样硬化和冠心病的发病风险显著提高（P＜0.05）。根据《辅助降血脂功能评价方法》（国食药监保化[2012]107 号），可判定高脂血症小鼠造模成功。上述结果也与前人研究报道一致[14-16]。

银杏肽干预显著降低了高脂血症小鼠血清TC、TG 和LDL-C 水平，升高了HDL-C 水平（P＜0.05），由此可判定银杏肽辅助降血脂功能动物实验结果阳性。银杏肽干预显著降低了高脂血症小鼠体质量和肝脏指数（P＜0.05），这与前人研究结果一致。火麻籽多肽[17]和猪骨胶原蛋白肽[18]也能显著降低小鼠体质量和肝脏指数。银杏肽干预对小鼠摄食量无显著性影响（P＞0.05），而钱珊珊等[13]发现大豆活性肽显著降低了高脂模型组小鼠的采食量，推测这与活性肽的来源和添加量等有关。银杏肽干预显著提高了脂肪表观消化率（P＜0.05），可能是由于银杏肽为两性化合物，具有良好的乳化性，银杏肽作为乳化剂提高了高脂血症小鼠对高脂膳食中脂肪的消化能力。田许等[11]研究表明鱼胶原蛋白肽干预也提高了高脂血症小鼠的脂肪表观消化率。

动物试验和临床试验表明，IL-6、TNF-α、IL-1β、单核细胞趋化蛋白-1、C-反应蛋白和趋化因子16 等炎性标志物与高脂血症和动脉粥样硬化的发生进展密切相关[19-20]。高脂血症患者中TNF-α与TC、TG 水平显著正相关；TNF-α在炎症过程与动脉粥样硬化进展过程中扮演着重要角色，TNF-α可通过激活NF-κB、STAT3 等信号通路调节血管平滑肌细胞的迁移和增殖，进而参与动脉粥样硬化斑块的发生和进展[21]。IL-6 是炎症过程的关键介质之一，可导致血浆C-反应蛋白、纤维蛋白原和纤溶酶原水平升高；近年来，IL-6 被认为是脑血管疾病的风险标志物和动脉粥样硬化治疗的新靶点[22]。本研究结果表明，低、中、高剂量银杏肽均能显著降低小鼠血清IL-6 和TNF-α水平（P＜0.05），提示银杏肽可缓解高脂膳食诱导的炎性损伤，通过抑制促炎细胞因子表达而发挥对高脂血症小鼠的降脂作用，有关银杏肽抑制IL-6 和TNF-α表达水平的信号通路有待后续进一步研究。

大量研究表明，氧化应激是高脂血症发生发展的早期事件，高脂血症患者中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶活性下降，MDA 水平升高；适当摄入外源抗氧化剂，拮抗高脂膳食导致的氧化应激，被认为有助于高脂血症的防治[23-25]。TAOC 水平下降被认为是氧化应激发生的信号[26]；脊椎动物的T-SOD 包括Cu/Zn-SOD 和Mn-SOD 两类[27]；MDA 被认为是反映机体氧化应激状态的重要标志物[28]。本研究中，低、中、高剂量银杏肽均显著提高了高脂血症小鼠肝脏T-AOC 和T-SOD 活性，降低了MDA 水平（P＜0.05），表明银杏肽通过提高机体抗氧化能力，发挥对高脂血症小鼠的降脂作用。毛瑞雪等[29]研究表明裸燕麦低聚肽可缓解血脂异常大鼠的脂代谢紊乱，其作用机制与抗氧化应激相关，这与本研究结果一致。而李迪等[30]虽未观察到吉林人参低聚肽对高脂血症大鼠的辅助降血脂作用，但该肽可降低血清和肝脏MDA 水平，提高SOD 和谷胱甘肽过氧化物酶活性。有关银杏肽在体内提高抗氧化酶活性所涉及的信号通路有待后续进一步研究。

综上所述，银杏肽能够降低高脂血症小鼠体质量、肝脏指数，降低血清TC、TG、LDL-C 水平，提高HDL-C 水平和脂肪表观消化率，对小鼠摄食量无显著性影响，缓解高脂膳食诱导的炎性损伤，提高小鼠的抗氧化能力，降低动脉粥样硬化和冠心病的发病风险。结果提示银杏肽对高脂膳食诱导的高脂血症小鼠具有辅助降脂作用，其作用机制与提高机体抗氧化能力和抑制促炎细胞因子表达有关。