肠道条件和粒径对加工山核桃体外消化的影响

邵宇辰，穆宏磊，陈杭君，殷军艺，房祥军，吴伟杰，刘瑞玲，韩延超，郜海燕，*

(1.南昌大学 食品学院，江西 南昌 330036； 2.浙江省农业科学院 食品科学研究所，农业农村部果品产后处理重点实验室，中国轻工业果蔬保鲜与加工重点实验室，浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，浙江 杭州 310021)

山核桃(Sarg.)属于胡桃科山核桃属，主要分布在浙江临安、昌化和安徽皖南山区，是我国特有的坚果。山核桃具有较高的营养价值，其果实含有丰富的脂肪酸，且主要是以油酸为代表的单不饱和脂肪酸(MUFA)，其次是亚油酸、亚麻酸等，不饱和脂肪酸对心血管疾病有良好的预防作用，对降血压血脂、提高细胞活性、调节儿童视力和智力有积极影响。山核桃还含有丰富的蛋白质和氨基酸，且氨基酸组成合理，符合人体营养需求。此外，山核桃还含有多酚、维生素E等抗氧化物质以及丰富的生物活性物质。

由于山核桃仁中含有大量的单宁等多酚类化合物，生食口感酸涩，不易被消费者接受，通常以加工品形式销售。目前市场上的山核桃加工方式主要为烘烤，烘烤对于山核桃的营养成分具有很大影响。因此，加工方式在改变营养物质含量和结构的基础上，如何影响营养物质的消化特性有待进一步研究。

胰腺外分泌功能不全(EPI)是一种营养消化不良综合征，主要指各种胰腺消化酶分泌减少，导致人体对营养素的吸收利用率降低，营养状况和生活质量下降。健康成年人的肠道pH为 7，肠道内胆盐浓度维持在10 mmol·L左右。EPI患者的肠道pH低于7，胆盐浓度也在1～10 mmol·L，因此，不同的肠道条件对消化会产生显著影响。咀嚼将大块的食物分解为小颗粒食糜，从口腔进入胃肠道进行消化。食物粒径大小与胃排空率密切相关，对营养物质的消化吸收也有重要影响。Gao等的研究表明，小颗粒的面包更容易被唾液浸渍，在胃中更容易分解消化。Mennah-Govela等研究表明，在胃消化中，颗粒大小影响食物的水分吸收，并进一步影响食物的分解消化。本研究基于健康成人和EPI患者的肠道条件，进行体外模拟消化实验，探究粒径大小和肠道条件对山核桃体外消化过程中脂肪、蛋白质和抗氧化活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山核桃购于杭州临安创辉食品厂；α-淀粉酶、胰酶、胰脂酶，Sigma-Aldrich公司；胃蛋白酶、胆盐，上海阿拉丁有限公司；游离脂肪酸试剂盒，上海优选生物科技有限公司；配制模拟消化液所用无机试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

XA105型电子天平，梅特勒-托利多公司；XMTD-8222型水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；Free Zone.2.5plus真空冷冻干燥机，美国Labconco公司；FE20台式pH计，梅特勒-托利多公司；Spark 10M多功能酶标仪，瑞士TECAN公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

加工山核桃：裂壳→150 ℃烘烤75 min→冷却至室温，脱壳取样。

粉碎：为了模拟山核桃在人体口腔经咀嚼后的状态，对山核桃进行粉碎处理：将脱壳后的山核桃用研钵研磨15 min，过20目金属筛，得到粒径不同的山核桃颗粒，其中，粒径≥0.83 mm的颗粒为大粒径(large particle， LP)，粒径<0.83 mm的颗粒为小粒径(small particle， SP)。

1.3.2 山核桃体外模拟消化

模拟消化液储备液配制。根据Minekus等提出的静态体外模拟消化方法稍作改动，配制1.25倍浓度模拟消化液储备液，包括模拟唾液(SSF)、模拟胃液(SGF)和模拟肠液(SIF)，各储备液中盐溶液浓度如下：

SSF：1.5 mmol·LCaCl(HO)、0.06 mmol·L(NH)CO、0.15 mmol·LMgCl(HO)、13.6 mmol·LNaHCO、3.7 mmol·LKHPO、15.1 mmol·LKCl。

SGF：0.15 mmol·LCaCl(HO)、0.5 mmol·L(NH)CO、0.12 mmol·LMgCl(HO)、47.2 mmol·LNaCl、25 mmol·LNaHCO、0.9 mmol·LKHPO、6.9 mmol·LKCl。

SIF：0.6 mmol·LCaCl(HO)、0.33 mmol·LMgCl(HO)、38.4 mmol·LNaCl、85 mmol·LNaHCO、0.8 mmol·LKHPO、6.8 mmol·LKCl。

消化储备液配制完毕后，需调节SSF至pH 7，SGF至pH 3，SIF至pH 7，每次使用前需重新测量并调整。不同消化阶段的酶溶液应用相应的模拟消化液配制，且酶溶液应测定酶活性，现用现配。

体外消化过程。口腔消化模拟：称取2.5 g样品，加2.5 mL水以保证食糜状态与实际消化状态一致，加入5 mL含有750 U α-淀粉酶的SSF储备液，混合均匀，并用1 mol·LNaOH调节pH至7.0，置于37 ℃恒温振荡培养箱中，避光振荡2 min，取出放入37 ℃水浴锅中。

胃消化模拟：向经过口腔消化的样品中加入10 mL含有4 000 U胃蛋白酶的SGF储备液，混匀，并用1 mol·LHCl调节pH至3.0，置于37 ℃恒温振荡培养箱中，避光振荡120 min，取出放入37 ℃水浴锅中。

肠消化模拟：向经过胃消化的样品中加入20 mL含有1 mmol·L或10 mmol·L胆汁和一定浓度(0、1 000、2 000、3 000、4 000 U)胰脂酶的SIF储备液，混合均匀，并用1 mol·LNaOH调节pH至6.0或7.0，置于37 ℃恒温振荡培养箱中，避光振荡120 min，取出，将消化样品放入液氮中，静置10 min，终止反应。

实验进行前，将SSF、SGF和SIF储备液及酶溶液预热至37 ℃，以供使用。每组实验重复3次。

体外消化实验设计。本实验中，体外消化实验分为两组，设计如下：第一组：固定肠道条件，即肠道pH 6，胆盐浓度为1 mmol·L，设置胰脂酶浓度为0、1 000、2 000、3 000和4 000 U·mL；第二组：固定胰脂酶浓度为2 000 U·mL，肠道条件和胆盐浓度组合为：pH 6/胆盐浓度1 mmol·L，pH 6/胆盐浓度10 mmol·L，pH 7/胆盐浓度1 mmol·L，pH 7/胆盐浓度10 mmol·L。其中，pH 6/胆盐浓度1 mmol·L是根据EPI人群的肠道情况设定的条件，而pH 7/胆盐浓度10 mmol·L则是根据健康成年人的肠道条件设定的。

1.3.3 基质降解率(MDI)

消化结束时，分散在消化液中的食物精细颗粒被认为是已降解消化的部分。因此基质降解率是由这部分食物与固体食物总量的比值确定的。将消化结束的样品离心分离，上清液过20目筛，残渣与固体沉淀合并转移至预先称重的铝盘上，并于50 ℃烘箱放置48 h。称量确定固体质量，根据文献[14]计算MDI。

1.3.4 脂肪消化率

脂肪经消化水解后，生成游离脂肪酸(FFA)，与铜离子结合形成脂肪酸铜盐，并溶于氯仿，因此可测定FFA含量，根据消化液中FFA的释放量可计算脂肪消化率。

取50 μL消化上清液，用500 μL正庚烷、无水甲醇和氯仿混合溶液溶解，加入200 μL铜离子试剂，振荡10 min后离心，取200 μL上清加入800 μL显色剂，充分振荡2 min，静置15 min，于550 nm下测定吸光值，同时制作棕榈酸标准曲线。

1.3.5 蛋白质消化率

蛋白质在人体内的消化反应主要是肽键断裂，释放出α-氨基酸，因此可以通过测定消化过程中释放出的α-氨基酸的含量与样品中α-氨基酸总量的比例来反映。

采用茚三酮法测定消化液中游离氨基酸含量，根据GB/T 8314—2013方法稍作改动：取200 μL消化上清液，注入10 mL比色管，加入0.5 mL磷酸缓冲液(pH 8)和2%茚三酮溶液，沸水加热15 min，冷却至室温后定容至10 mL，摇匀，静置10 min，转移至96微孔板，在570 nm处测定吸光值。同时用谷氨酸制作标准曲线

1.3.6 总酚类物质含量测定

根据周拥军等的方法并稍做修改，取1 mL消化上清液进行冷冻干燥，然后用1 mL 60%乙醇溶液复溶，并避光超声15 min，离心，上清液即为消化样品的多酚提取液，用于后续实验分析。

采用福林酚法测定总酚含量。吸取200 μL多酚提取液，加入100 μL福林酚试剂，静置6 min后，加入300 μL 7.5%的NaCO溶液，反应1.5 h，取200 μL于96微孔板中，在760 nm处测定吸光值。全程避光，以没食子酸作为参考制作标准曲线，结果以每毫克没食子酸当量表示。

1.3.7 DPPH自由基清除能力测定

根据Multlu-Ingok等的方法稍作修改，取25 μL多酚提取液(提取方法同1.3.5节)添加到96微孔板中，然后加入175 μL DPPH乙醇溶液(150 mmol·L)，振摇混匀，避光反应30 min，于517 nm处测定吸光值，并计算DPPH自由基清除率。

1.3.8 铁离子还原能力(FRAP)测定

参考Xiao等的方法，并稍作改动。FRAP工作液是由醋酸钠缓冲液、FeCl和2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)溶液以10∶1∶1的比例混合而成。吸取5 μL多酚提取液于96微孔板中，加入185 μL FRAP试剂，振荡混匀，37 ℃孵育5 min，在593 nm下测定吸光值，同时用FeSO制作标准曲线。

1.4 数据处理

通过SPSS进行方差分析(ANOVA)，从而研究山核桃粒径和肠道条件(pH、胆盐浓度、胰脂酶浓度)对山核桃消化的MDI、蛋白质消化率、脂肪消化率和抗氧化能力(总酚含量、DPPH、FRAP)的影响。<0.05时，因素影响显著，具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 粒径大小和肠道条件对MDI的影响

基质降解率表征了食物在消化过程中破碎分解的程度，表1显示了在胰脂酶浓度为2 000 U·mL时，山核桃粒径、肠道pH、胆盐浓度及其相互作用对山核桃消化基质降解率的影响。可以看出，粒径对山核桃MDI有极显著影响，胆盐浓度、pH及相互作用对山核桃MDI有影响。图1显示了在胰脂酶浓度为2 000 U·mL时，加工山核桃在不同粒径、肠道pH、胆盐浓度和胰脂酶浓度条件下的基质降解率。以不同粒径的山核桃模拟咀嚼后的食物颗粒状态，由图1可以看出，LP样品的MDI范围仅为24.40%～33.87%，而SP样品的MDI则达到了56.13%～62.53%。胰脂酶浓度变化对于MDI影响较小，未见明显的变化规律。

咀嚼可以将大块的固体食物转化为小颗粒，增加消化和吸收的比表面积，食物的颗粒大小会影响胃排空率，咀嚼不足可能导致消化不良。因此,固体食物的分解程度对于消化过程中营养物质的生物利用度具有十分重要的影响。烘烤使坚果形成细胞间和细胞内通道，使消化液更容易渗透，这可能有助于坚果颗粒的消化分解。固体食物在消化过程中因吸收大量水而软化，并进一步分解为精细颗粒溶于消化液中。

2.2 粒径大小和肠道条件对脂肪消化率的影响

脂肪是山核桃中储存能量的主要成分，也是含量最高的营养成分，达到69.8%～74.1%。以不饱和脂肪酸为主，种类丰富。本实验研究了加工山核桃的脂肪在不同咀嚼程度(不同粒径)和肠道条件下的消化情况。表1显示了粒径、胆盐浓度、肠道pH以及它们之间的交互作用对于脂肪消化过程是否存在显著影响。结果表明，粒径大小和pH对脂肪消化的影响最大，胆盐浓度对脂肪消化也有极显著的影响，粒径-pH、胆盐浓度-pH、粒径-胆盐浓度-pH交互作用对脂肪消化也有极显著影响。图2显示了粒径和肠道条件对山核桃体外消化中脂肪消化率的影响。可以看出LP山核桃的脂肪消化率最大仅为28.80%，而小颗粒山核桃最高可达到53.15%，大颗粒山核桃脂肪消化率显著低于小颗粒，这一结果在不同胆盐浓度和pH以及胰脂酶浓度条件下均有体现。pH 7时，山核桃的脂肪消化率为26.51%～53.15%，pH 6时，脂肪消化率为19.32%～44.48%。二者具有明显差异，在肠道pH 7时，山核桃的脂肪消化率更高。该结果在不同粒径大小以及胰脂酶浓度条件时均有体现。胰脂酶浓度对脂肪消化率影响极大，脂肪消化率随着胰脂酶浓度增大而上升。当酶浓度从1 000 U·mL升至2 000 U·mL时，脂肪消化率急剧上升。

山核桃脂质主要以三酰甘油的形式存在，脂肪体被单层磷脂层包裹。和其他营养物质一样，脂肪的释放和消化程度取决于其在肠道内的组织状态，因此在咀嚼过程中，细胞壁是否被破坏，脂肪体是否被释放是影响脂肪消化的关键因素。小颗粒食物与消化酶、胆盐等接触面积更大，且脂肪等营养物质的释放更彻底。脂肪的水解受到pH影响是因为胰脂酶对于pH条件敏感，在不同的pH环境下胰脂酶水解脂肪的能力不同，pH 7时，胰脂酶对脂肪的水解程度更高。在肠道中，胆盐将脂肪乳化分解成脂肪微粒，进一步发生水解作用。胆盐浓度低导致脂肪乳化不均匀不彻底，阻碍脂肪的进一步消化水解。

表1 影响因素及交互作用对MDI、脂肪消化率、蛋白质消化率、总酚、DPPH清除率和FRAP的影响

不同处理间没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。The bars without the same lowercase letters show the significant difference (P<0.05). The same as below.图1 粒径和肠道条件对山核桃体外消化MDI的影响Fig.1 Effects of particle size and intestinal conditions on in vitro MDI of Carya cathayensis Sarg.

图2 粒径和肠道条件对山核桃体外消化脂肪消化率的影响Fig.2 Effects of particle size and intestinal conditions on in vitro fat digestibility of Carya cathayensis Sarg.

2.3 粒径大小和肠道条件对蛋白质消化率的影响

山核桃中蛋白质含量高，氨基酸组成符合人体需求，各必需氨基酸含量也很高。表1显示，在体外模拟消化中，粒径大小和胆盐浓度对加工山核桃蛋白质消化有极显著影响，粒径-胆盐浓度和粒径-pH协同作用也有显著影响。图3显示了粒径和肠道条件对山核桃体外消化蛋白质消化率的影响。根据图3可以得知，LP山核桃蛋白质消化率(22.63%～52.61%)略低于SP山核桃(27.99%～56.17%)。当加工山核桃在pH 6，胆盐浓度1 mmol·L，胰脂酶浓度3 000和4 000 U·mL条件下消化时，不同粒径山核桃的蛋白质消化率无明显区别，在pH 6，胆盐浓度10 mmol·L，胰脂酶浓度2 000 U·mL条件下消化加工山核桃也有同样结果。胰脂酶浓度对蛋白质消化率有显著影响，随着胰脂酶浓度增加，蛋白质消化率呈现上升趋势。

有研究表明，粒径对蛋白质消化的影响与对脂肪消化的影响相似，小粒径的坚果颗粒提高了蛋白质的释放率，并且增加了与消化酶的接触面积，因此提高了蛋白质消化率。胆盐浓度较高时，蛋白质消化率较低，这可能是因为胆盐与脂肪形成乳化微粒时阻碍了部分蛋白质与消化酶之间的结合，进而降低了蛋白质消化率。

2.4 粒径大小和肠道条件对总酚的影响

山核桃仁含有大量的多酚类物质，具有很强的抗氧化活性。由表1可以看出，粒径大小对于消化上清液中酚类物质含量影响显著，pH对酚类有影响。其余因素对酚类影响不明显。

图4可以看出，SP山核桃体外消化酚类释放量约为8.45 mg·g，高于LP山核桃的7.50 mg·g。胰脂酶浓度的变化对于消化液中酚类含量影响不明显，仅在消化大颗粒山核桃时，酚类含量随着胰脂酶浓度升高呈现先上升后下降趋势，这可能是因为在高浓度胰脂酶条件下，酚类和胰脂酶发生结合有关，胰脂酶作用于酚类，改变了酚类的存在形式，从而影响酚类的消化。

图3 粒径和肠道条件对山核桃体外消化蛋白质消化率的影响Fig.3 Effects of particle size and intestinal conditions on in vitro protein digestibility of Carya cathayensis Sarg.

图4 粒径和肠道条件对山核桃体外消化总酚的影响Fig.4 Effects of particle size and intestinal conditions on in vitro total phenols of Carya cathayensis Sarg.

2.5 粒径大小和肠道条件对DPPH清除率的影响

表1显示，粒径、胆盐浓度和pH对山核桃体外消化DPPH清除率的影响极显著，粒径-胆盐浓度、粒径-pH交互作用对加工山核桃有影响。图5显示，在LP山核桃消化中，DPPH清除率仅为23.05%～48.08%，在SP中达到了65.90%～84.03%；在pH 6时，DPPH清除率为59.19%(平均值)，pH 7时为46.83%(平均值)；胆盐浓度为1 mmol·L时，DPPH清除率为50.35%(平均值)，为10 mmol·L时能达到55.67%(平均值)。胰脂酶浓度对DPPH清除活性具有微弱的影响，在酶浓度为3 000 U·mL时，山核桃消化液DPPH清除活性最高，而在4 000 U·mL时DPPH清除活性稍有降低。

酚类等抗氧化物质在不同pH条件下会发生变化，在中性和碱性条件下，有机酸降解会降低抗氧化能力，同样在酸性条件下，中性或偏碱性抗氧化物质也会受到影响。粒径和pH可能是通过影响抗氧化物质含量和结构进而作用于DPPH自由基清除活性。胰脂酶和消化液中抗氧化物质的相互作用可能影响DPPH清除活性。胰脂酶既可以水解酚类与蛋白之间的结合键，提高抗氧化活性；又可以与酚类结合，降低抗氧化活性。所以在一定浓度范围内，山核桃消化液DPPH清除活性随胰脂酶浓度增大而上升，而在浓度为4 000 U·mL时有所下降。

2.6 粒径大小和肠道条件对FRAP能力的影响

表1显示粒径、胆盐浓度和pH对山核桃体外消化FRAP能力的影响极显著，粒径-胆盐浓度、粒径-pH和粒径-胆盐浓度-pH的交互作用对山核桃的FRAP能力也有影响。这与影响DPPH自由基清除活性的因素相似。由图6可知，FRAP能力与DPPH自由基清除活性表现出了相似的结果，但不同消化组之间的差异性更加明显。在LP山核桃消化中，FRAP能力仅为0.89～4.95 mmol·L·g，在SP中达到了4.83～9.67 mmol·L·g；在pH 6时，FRAP能力为5.35 mmol·L·g，pH 7时为3.62 mmol·L·g；

图5 粒径和肠道条件对山核桃体外消化DPPH清除率的影响Fig.5 Effects of particle size and intestinal conditions on in vitro scavenging of DPPH radical of Carya cathayensis Sarg.

图6 粒径和肠道条件对山核桃体外消化FRAP能力的影响Fig.6 Effects of particle size and intestinal conditions on in vitro FRAP antioxidant ability of Carya cathayensis Sarg.

胆盐浓度为1 mmol·L时，FRAP能力为3.91 mmol·L·g，为10 mmol·L时能达到5.05 mmol·L·g。酶浓度对FRAP能力的影响无明显规律。

3 结论

通过本研究可以得知，粒径大小对山核桃体外消化影响显著，对蛋白质、脂肪消化率和抗氧化能力都有显著影响，且无论肠道条件如何，SP山核桃的MDI均高于LP，在蛋白质消化、脂肪消化和抗氧化活性中也得到了同样的结果。LP山核桃中营养物质和活性物质的释放量低于SP山核桃，并且大颗粒山核桃与消化液中酶和胆盐等的接触面积也明显低于小颗粒。因此，大颗粒山核桃比小颗粒消化效果更差。

EPI人群肠道条件与健康成人之间肠道条件差异较大，以pH和胆盐浓度、胰脂酶浓度不同为主。肠道pH和胆盐浓度主要影响脂肪消化和抗氧化活性，pH 7，胆盐浓度10 mmol·L时，脂肪消化效果好于EPI肠道条件下的脂肪消化效果。pH和胆盐浓度对山核桃消化酚类无显著影响，但对DPPH清除率和FRAP能力影响极显著。

胰脂酶浓度对山核桃消化MDI无明显影响，对总酚和抗氧化活性影响较小，但对于脂肪和蛋白质消化影响显著，胰脂酶浓度越高，脂肪和蛋白质消化效果越好，但在消化酚类时，胰脂酶浓度过高会抑制酚类消化。综合而言，在胰脂酶浓度为2 000 U·mL和3 000 U·mL时，消化效果最佳。

因此，EPI人群可以选择摄入适量的胰酶补充剂，提高对脂肪、蛋白质等常量营养素的消化吸收能力，同时日常饮食中可以适量摄取益生元类食物，有助于调节肠道pH，维持肠道稳态，增进营养素消化吸收。