CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物中的应用与政策监管

偶 春，张 敏，丁 霖，姚侠妹，王泽璐，彭 城，*，徐俊锋

(1.阜阳师范大学 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037； 2.浙江省农业科学院 浙江省农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，浙江 杭州 310021； 3.安徽建筑大学 建筑与规划学院，安徽 合肥 230022)

全球人口快速增加，气候急剧变化，随之而来的是耕地数量不断减少，自然资源极度稀缺，农业生产可持续发展形势严峻等一系列农业生态发展问题。当前，迫切需要通过最先进、最前沿的技术提高作物产量，改善作物品质。基因编辑技术促进了对基因位点的精确、高效和有针对性的修改，深刻改变了植物研究领域创新版图，并在作物改良方面具有巨大潜力。基因编辑监管政策的制定使部分基因编辑产品商业化成为现实，有利于农业的可持续发展和粮食安全，也使得基因编辑成为目前最炙手可热的分子生物技术。

1 基因编辑技术的发展

基因编辑技术是一项对生物体内源基因进行精准定点修饰的技术，通过核酸酶来剪切DNA链(DNA strand)，对特定目标序列DNA片段的敲除和插入等，能够高效率、低成本地定点编辑多种基因，从而影响并改变基因的分子功能。目前，应用在各领域最多的基因编辑系统主要是成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9， CRISPR/Cas9)技术。锌指核酸酶技术(zinc-finger nucleases，ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶技术(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)已较少应用。

1.1 基因编辑技术的介绍

1.1.1 ZFNs和TALENs

ZFNs和TALENs作为前两代基因编辑技术在基因工程改造领域具有里程碑意义。两种基因编辑技术分别是通过锌指蛋白(zinc finger protein，ZFP)和转录启动样效应蛋白(transcription activator-like effector，TALE)靶向识别并结合待编辑的DNA序列，与核酸内切酶Ⅰ融合后，可对目标序列切割。在DNA双链断裂(double-stranded breaks，DSBs)之后，通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重组(homologous recombination，HR)来修复连接。两种基因编辑技术已被广泛应用于靶向基因突变，甚至在生物制药、相关癌症疾病的基因治疗方面也具有重要指导意义，具有非常广泛的应用前景。

1.1.2 CRISPR/Cas及其作用原理

与之前的基因编辑技术相比，CRISPR/Cas系统因低成本、易操作、高效率等优点受到学术和行业内人士的欢迎，成为新一代基因编辑技术，该技术的开发者Charpentier E和Doudna J A于2020年获得诺贝尔化学奖。利用该技术可以快速高效地实现对生物基因组的定点编辑修饰，在植物中，修饰后的植物体在当代就可获得纯合植株，通过自交或回交的方法即可剔除外源载体序列，使编辑后的植株与自然界的自发突变(自然变异)或人工诱变的突变体植株没有本质区别。根据Cas编码基因核心元件的序列差异，CRISPR/Cas系统可以分为Ⅰ类系统、Ⅱ类系统和Ⅲ类系统。其中，CRISPR/Cas9是唯一被优先应用于基因编辑的Ⅱ类系统，被称为目前为止最强大的基因编辑工具。CRISPR/Cas9已成为作物基因工程的最先进系统之一。

CRISPR/Cas9系统最常用的Cas9蛋白来自酿脓链球杆菌，Cas9蛋白与复合物结合，识别外源DNA序列上的原型间隔毗邻序列(proto-spacer adjacent motif，PAM)后，整合到CRISPR位点的2个相邻重复序列之间的间隔。当外源物质再次入侵时，外源DNA片段的CRISPR基因座被整合转录生成pre-crRNA(pre-spacer containing RNA)和反式激活RNA(trans-activating crRNA， tracrRNA)，pre-crRNA被核酶Ⅲ与tracrRNA切割，形成成熟的CRISPR RNA(CRISPRRNAs， crRNA)；研究人员通过人为方式将crRNA和tracrRNA连接形成向导RNA(single guide RNA， sgRNA)的嵌合RNA分子，通过sgRNA与靶基因互补配对，Cas9可切割sgRNA互补配对的20个核苷酸序列的活性区域(2个核酸酶结构域HNH和RuvC)，引起DNA双链断裂，再利用NHEJ(non-homologous end joining)对DNA双链断裂进行修复或进行碱基插入、敲除、替换等突变类型，技术原理图见图1，根据Gao等稍作修改。

图1 CRISPR/Cas9技术原理图[19]Fig.1 Technical schematic diagram of CRISPR/Cas9[19]

2 CRISPR/Cas9技术在植物中的应用

由于CRISPR/Cas9基因编辑技术周期短且工作量小，编辑效率高，实现了作物定向改造和精准稳定的遗传，其为植物基因编辑体系建立，功能研究与作物性状改良提供了强有力的手段。随之而来的是，越来越多的基因编辑研究应用实例被报道，国内外加快了基因编辑技术的推进和改良步伐，基因编辑产品也逐渐为大众所接受，并走向商业化。

2.1 植物CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立

目前，CRISPR/Cas9基因编辑技术已经被广泛应用于各种单子叶植物和双子叶植物中，如水稻(L.)、小麦(L.)、马铃薯(L.)、玉米(L.)、大豆()和拟南芥()等。在Feng等的研究中，他们通过OsU6-2启动子驱动sgRNA，并将这种RNA和由35S启动子驱动的含核定位信号的hSpCAS9亚克隆到同一个表达载体中，研究5、和这3个基因，在获得的T代转基因株系中，除的突变效率仅为5%外，另外2个基因的突变效率都高达26%～84%，且大约10%的T代是纯合突变株系。Zhang等针对、3、、1、1、5、1、5、和基因分别设计sgRNA，在获得的T代转基因株系中，平均44.4%产生了突变，其中，纯合突变的突变株系占7.7%，提高了转化效率。Shan等利用水稻密码子优化Cas9核酸酶基因，并通过水稻的U3启动子对sgRNA的转录进行控制，对水稻的基因进行定点突变，在T代便获得了纯合基因敲除水稻突变体，突变体水稻有白化表型。Wang等利用基因编辑技术定向修饰了小麦的3个等位基因，筛选了基因功能缺失的小麦株系，获得了广谱白粉病抗性的小麦品系。Zhang等的研究结果表明，在小麦愈伤组织细胞中瞬时表达CRISPR/Cas9 DNA或IVT可以有效诱导靶向基因，并形成无转基因残留片段的株系。在T代，他们成功地获得了在六倍体面包小麦(cvs Bobwhite和Kenong 199)和四倍体硬粒小麦(cvs Shimai 11和Yumai 4)中未检测到转基因成分的纯合突变体7、2、2、7，突变可以稳定地遗传给后代。CRISPR/Cas9技术在植物建立基因编辑体系方面具有重要的指导性和辅助性意义。

2.2 CRISPR/Cas9技术在植物性状改良中的应用

CRISPR/Cas9技术已在植物改良应用中得到开发，主要包括提高植物抗性、提高产量、改善作物品质等。在提高抗性方面，Wang等利用CRISPR/Cas9系统敲除了粳稻中的922基因，结果发现，纯合突变株系的稻瘟病抗性与野生型相比显著增强，农艺性状没有明显改变。Nekrasov等通过编辑1获得抗白粉病番茄，Ortigosa等通过破坏2获得了抗细菌斑点番茄。在提高作物产量方面，Li等利用CRISPR/Cas9系统对水稻品种中华11的1、1、1和3基因进行编辑，分别产生了直立穗、高籽粒数和颗粒饱满的突变体。Syahariza等利用CRISPR/Cas9技术将番茄中的5突变失活后，番茄生育期缩短，花期提前，更有利于番茄产量的提升。在改善作物品质方面，Wang等对两种玉米BADH2同源物ZmBADH2a和ZmBADH2b进行了表征；然后，他们使用CRISPR/Cas在4个玉米自交系中产生和单突变体，以及双突变体，双突变体种子中有爆米花般的香味，但单突变体和野生型种子中都没有。Zhang等的研究表明，2是谷类作物中的一个关键基因，当其被破坏时会增加小麦的粒重和蛋白质含量。用CRISPR/Cas9技术编辑亚麻荠2基因，可以提高亚麻荠油酸含量，同时降低亚麻荠中的多不饱和脂肪酸。通过常规育种很难或不可能产生新的作物种质，在诸多定向提升改良植物性状的实验室实验和大田试验中，CRISPR/Cas9技术都表现得非常理想，这证明了基因编辑技术在作物改良中的潜力和多功能性。

2.3 基因编辑技术介入的产品商业化应用

CRISPR/Cas9技术对农业资源可持续发展和全球粮食安全至关重要，是一项能将不可能变为可能的改造技术。目前，少数经过基因编辑的作物在一些地区商业化。2015年，美国种植了4 000 hmSU油菜TM，这是全球首个商业化的基因组编辑作物。2016年，杂志报道，由科学家杨亦农利用CRISPR/Cas9基因编辑技术得到的人工蘑菇已经开始被种植售卖，美国农业农村部(USDA)认为不需特殊监管程序来监管这种蘑菇的培养和售卖。2018年，英国对经过基因编辑的亚麻荠()进行田间试验，生产一种与橄榄油相似的产品。2021年9月11日，MHLW召开专家会议，研究了一种基因编辑番茄，发现该番茄富含抑制血压上升功能的成分——γ-氨基丁酸(GABA)，其含量是普通番茄的5倍多。在2020年全国两会小组讨论上，全国政协委员、中国科学院院士曹晓风说：“基因编辑育种，就是农业领域的5G技术”。我国的基因编辑技术研发优势全球领先，但是一直没有基因编辑作物作为商品推广销售，建议加快花卉、盆栽等一系列经济作物的推广，加快基因编辑产业化步伐。

3 CRISPR/Cas9系统的局限性与改进方法

3.1 脱靶问题

脱靶问题是CRISPR/Cas9技术的主要局限性之一，克服高频的脱靶效应一直以来都是科研人员迫切需要解决的焦点问题。脱靶效应往往是由于该技术会出现sgRNA与DNA间的错配，在基因组中，与靶位点序列相似的序列也会被CRISPR/Cas9错误识别并切割。在最新的一项研究中，Walton等开发了一种名为SpG的化脓链球菌Cas9变体，该变体几乎完全消除了PAM的局限性，并能够靶向更广泛的NGNPAM；实验优化后，他们又开发出SpRY变体，使用2个新型Cas9变体使研究人员获得与疾病相关的全新基因变体；新的实验实现了高精准靶向编辑，这给未来进一步深入探究生物的基因功能提供前沿技术支持。此外，可以通过回交消除一定数量的脱靶突变，通过瞬时表达编辑试剂来增强CRISPR-Cas的特异性。不可忽略的是，BLAST工具和生物信息软件可以与NCBI(National Center for Biotechnology Information)平台相结合，以最大限度地减少脱靶频率。然而，有研究表明，在植物中避免基因脱靶情况并没有在动物中那么重要，因为植物中组织诱变，或者其他物理化学诱变的风险远高于CRISPR/Cas9脱靶风险。

3.2 编辑效率问题

CRISPR/Cas9系统中的靶点效率问题几乎困扰着所有相关科研人员，其表现在CRISPR/Cas9系统对不同靶点的切割效率差异很大，许多靶点甚至检测不到突变位点。原则上，HDR(homology directed repair)介导的基因组编辑效率较低。研究人员通过使用双生病毒构建载体、植物体内基因靶向(GT)系统或化学修饰稳定供体模板等各种策略来提高植物细胞中的HDR效率，但是该过程本身在植物体细胞中仍然效率极低。为了克服这些限制，研究人员将几种核酸脱氨酶与CRISPR/nCas[如 nCas9(D10A)]融合以实现碱基编辑，开发了DNA碱基编辑系统，胞苷脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶可与CRISPR/nCas9(D10A)融合生成胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，从而实现在特定基因的靶区内CG替换为TA，或AT替换为GC。除碱基编辑外，Prime Editor通过将突变的M-MLV-RT(莫罗尼鼠白血病病毒逆转录酶)融合到催化受损的Cas9(H840A)的C-末端，并使用由sgRNA组成的针对特定位点的prime编辑导向RNA(pegRNA)进行编程，编码所需编辑的逆转录(RT)模板和引物结合位点(PBS)可以引入所有12类单核苷酸替换和预定义的小指标，而无需DSB(double strand break)。除了通过编辑器提高靶点效率外，Moren-Mateos等发现，靶点富集G而缺乏A可以提高sgRNA的稳定性和活性，并且建立了CRISPRscan系统，帮助科研人员筛选高效的靶位点；通过尝试优化Cas9启动子，在一定程度上提高了T、T代转化株系的编辑效率。Doench等发现，改变PAM序列，sgRNA的活性也会随之变化，PAMCGGT形式的序列效果比典型的NGG序列效果更好。最后，鉴于不同靶点切割效率的巨大差异，科研人员推测造成这一问题的原因可能是部分靶点的错误转录造成的。Xie等利用RNA策略在水稻中固化了所有sgRNA的转录起始位点，这大大增加了sgRNA的活性。此外，为帮助科研人员进行高效靶点的筛选，有很多科研人员建立了数据库。因此，进一步提高植物细胞中的基因编辑活性，还需期待有更多、更好的策略。

4 世界主要国家基因编辑安全管理概况

基因编辑技术在促进全球农业生产、改善农产品品质等方面拥有诸多其他技术无法替代的优点，但基因编辑技术给物种带来的遗传变异是否会对人类健康、生态环境带来潜在风险也是人们非常质疑和担心的问题，因此，必须建立科学严格的监管制度政策，在保障人类健康、动物健康和环境安全的前提下以达到基因编辑作物产业化发展的目的。目前，不同国家和地区对基因编辑产品持不同态度，尚未达成统一的规定。现在的监管框架主要分为两类，美国、阿根廷、加拿大、英国、日本和俄罗斯等是基于产品本身的监管模式，欧盟、澳大利亚、新西兰等是基于过程的监管模式。前者主要是针对最终产品的安全性，后者则侧重于创造新作物品种的技术。我国目前尚未制定明确的监管政策，对基因编辑的监管正在逐步推进中。

4.1 美国：基因编辑产品本身的监管政策

美国采取基于产品监管的法规，2016年4月，美国农业农村部(USDA)宣布采用CRISPR/Cas9编辑的植物，如抗褐变蘑菇和糯玉米等，从涵盖GMOs11的法规中豁免，将不再受其监管。2017年初，美国农业农村部提出一项调控基因编辑作物的规定：含有任何大小的缺失(SDN-1)或单碱基对替换(SDN-2)的产品将免于监管，面向市场销售。这种对基因工程植物态度的变化使美国育种产业的格局发生了翻天覆地的变化。目前，美国已经建立了比较完善的基因编辑和调控体系，可以及时适应和调整，以适应技术进步发展的需要。因此，美国的基因编辑技术研究在全球是最为积极的。

4.2 欧盟：基因编辑过程的监管政策

欧盟制定了一项基于过程的监管法规。2018年7月25日欧洲法院作出裁决：任何使用CRISPR技术改造的行为都将导致产品被归类为转基因产品。这一裁决是可预期的，因为在使用CRISPR时始终需要核酸sgRNA分子。对此，很多支持基因编辑的科学家们都难以接受，各成员国的学术界和业内人士都呼吁对基因编辑产品持接受态度，减少对其及其产业化推广的限制。在法国，基因编辑作物不受转基因政策监管。欧盟规定，有长期的安全记录且使用频率高的作物，可无须遵守指令所规定的义务，其成员国可与欧盟法规一致。这彰显出欧盟既包容又谨慎的监管态度。

4.3 英国：放宽对基因编辑产品的监管

英国在脱欧之后，放松了对基因编辑产品的监控。2021年9月29日，英国环境大臣尤斯蒂斯发布了一项基因编辑技术应用计划。该计划拟修改基因编辑技术相关法律法规：(1)对于通过自然变异或常规育种也能够获得的基因变化植物，简化审批，推动创新研发，该决策与澳大利亚相似；(2)修改转基因生物监管范畴，当基因编辑技术或其他遗传技术创制的生物其基因变化通过常规育种技术也能够获得时，可免除监管；(3)转基因监管法规将继续适用于含有外源DNA的基因编辑生物。英国环境、食品和农村事务部、英国食品标准局、英国植物育种者协会和英国罗斯林研究所的科学家对此计划表示支持，认为基因编辑技术在保障粮食生产、农业可持续发展、应对气候变化等方面具有重要作用。

4.4 日本：大力推进基因编辑产品商业化

日本由农林水产省(MAFF)、日本厚生劳动省(MHLW)、环境省(MOE)和文部科学省(MEXT)共同管理。2018年8月，日本MOE委员会建议，SDN-1而产生的基因编辑作物不应再纳入转基因监管范围。2019年3月，日本咨询小组建议监管基因编辑作物按监管常规作物的框架进行，经严格安全性审查，只需向政府登记即可上市，可直接出售给消费者。2020年初，日本监管机构制定了基因编辑食品和农产品的处理指南，MHLW和MAFF召集技术专家委员会在整个指南制定过程中提供指导，开展公众意见征询并发布各个部门的基因编辑食品和农产品指南。在将产品纳入基因编辑产品范围前，需要进行一个预咨询程序，确认该产品是否属于基因编辑产品，若属于基因编辑产品则对该产品豁免转基因产品监管程序。

4.5 中国：迫切需要科学明确的基因编辑监管政策

我国尚未出台明确的基因编辑产品监管规定，基因编辑产品作物尚未商业化。与此同时，我国政府为基因编辑研究提供了大量的财政支持。对基因编辑作物使用和商业化的监管障碍可能会延缓农业发展，甚至阻碍基因编辑技术在农业上的进展和应用。自2016年以来，我国科学家已多次在不同场合提出基于科学的基因编辑作物监管政策建议，对这类发展极为迅速的高新技术，希望政府主管部门高度重视，及时制定相应的监管法规。

5 CRISPR/Cas9技术的未来展望

基因编辑技术是生命科学领域出现的变革性技术。2012年，Doudna和Charpentier两位教授在《科学》发表论文“The Cas9 endonuclease can be programmed with guide RNA engineered as a single transcript to cleave any double-stranded DNA sequence”，这标志着对CRISPR/cas9系统的最后技术突破，为CRISPR作为基因编辑工具在各个领域的应用打下了坚实的基础。

中国在植物基因编辑方面的研究在国际上属于领先地位，农业基因编辑研究论文数量全球第一。自2013年CRISPR技术出现以后，我国农业领域基因编辑研究论文数量超过美国，排名全球第一；在农业领域基因编辑专利数量方面也具有明显的优势，在2017年6月之前，中国(259项)是第二名美国(61项)的4倍之多，是第三名欧洲(18项)的16倍之多。更重要的是，2017年6月以后我国农业领域基因编辑相关专利数量保持持续增长，而欧美则停滞不前，中国在农业基因编辑知识产权与竞争力方面占据世界领先地位。当前，越来越多的专家学者看好未来基因编辑作物市场。2021年8月18日，发表了来自Gordon等题为“Responsible governance of gene editing in agriculture and the environment”的评论文章，该文章认为基因编辑管理在农业和环境中应该遵循6个原则，即1—规避风险和提供切实的社会效益；2—稳健、包容的社会参与；3—有效、科学的政府监管；4—补充和补充监管监督的自愿最佳实践；5—环境中基因编辑产品的透明度；6—包容性地获取技术和资源。6个原则旨在为基因编辑技术的负责任创新和治理提供一个高级框架，Gordon等借鉴了部署转基因生物的经验教训，旨在开发一种更值得信赖、更具包容性和量身定制的基因编辑监管方法。当前，虽然各国在基于过程和基于产品本身两种不同的管理模式下监管态度不尽一致，但如果基因编辑作物只是单碱基或少量碱基突变，且没有外源基因插入，则接受度较高，可以看出，是否有外源基因的插入，可能是转变对基因编辑作物监管态度的关键点，少量碱基突变且无外源基因插入的基因编辑作物更容易被公众接受，或不必受法律监管。曹晓风、李家洋等院士呼吁我国基因编辑育种亟需政策支持，希望在科学安全的监管之下，更多的基因编辑作物能够走向商业化。目前，我国有待商业化应用的基因编辑农作物有中国农业大学研发的抗除草剂玉米，中国科学院的抗倒伏水稻，中国科学院遗传与发育生物学研究所的抗白粉病、抗除草剂小麦，使糖分改变的草莓等。基因编辑的广泛应用在生产实践中产生了革命性的影响，因此，可以预见在不远的将来，一旦出台明确、科学、可操作的植物基因编辑的相关法规与政策措施，我国便能充分发挥植物基因编辑产品研发的领先优势，以促进技术的进一步发展完善及其产业化应用，将研发优势转化为产品优势、产业优势，为保障国家粮食安全和生态安全提供强有力的技术支撑，造福人类社会。